Studium protein-proteinových interakcí v bakteriální pathogenesi: využití metodiky PIXL (photo-induced cross-linking)

Abstract

Gramnegativní bakterie druhu Bordetella pertussis jsou původci smrtelného lidského onemocnění označovaného jako pertuse, častěji jako černý kašel. Tyto bakterie produkují adenylátcyklázový toxin (ACT), který se váže na povrch makrofágů a umožňuje vpravit do cytosolu hostitelské buňky přes cytoplazmatickou membránu adenylátcyklázovou doménu (dAC). Abychom mohli studovat kovalentní interakce mezi proteiny pomocí fotochemického zesítění, byl náš studovaný protein exprimován s foto-methioninem (kyselinou L-2-amino-5,5- azi-hexanovou) v kultivačním médiu v bakteriálním kmenu Escherichia coli B834 (DE3). Foto- methionin je netoxickým analogem L-methioninu, takže je normálně inkorporován pomocí aminoacyl-tRNA syntház do struktury adenylátcyklázové domény. Maximální míry inkorporace foto-methioninu do struktury dAC bylo dosaženo po optimalizaci celého expresního protokolu. Celková míra inkorporace foto-methioninu do struktury proteinu po optimalizaci zjištěná hmotnostně-spektrometrickou analýzou byla až 80 %. Získaný protein s inkorporovaným foto- methioninem byl izolován. Byly provedeny síťovací experimenty s kalmodulinem a vláknitým hemaglutininem. Při těchto experimentech bylo provedeno jak fotochemické, tak i chemické zesítění. Vzniklé kovalentně zesítěné produkty byly rozděleny pomocí SDS-PAGE a...