Reptory spřažené s trimérními G proteiny v membránových doménách

Abstract

Conclusions our purposewastoseparďeplasmamembranefractioncharacterisedaslipid rafu (or mernbranedomains)andítndtheextentofG protein coupledreceptors(GPCRs) raft association.Threediffererrttechniqueswere applied- detergontextraction,alkaline treaÍnent wift sonicďion,andhomogenisation'We foundtha on|yTriton X.l00 treatmentledto lipid raffs separďon from bulk membranephase.Many markermoleculeshelpedus to characterise low (sucrose|5.25%)andhigh-density(sucrose40%)membranefractionsseparďedon sucrosederrsitygraďents after cells homogenisation'ďkďine or detergentextraction.Low density,dercrgentresisiantmembranefragnents, were characterisedby presenceof mernbranedomainsproteinscaveolin,flotillin, andGPl-boundalkalinephosphatase,CD55, CD58, andCD59, whereashigh-densitysucrosegradientfractionwereenrichedin non-raft proteinsNA/K-ATPase' MHC l' cDl47' calnexinandtrarsferrinerec€ptoÍ'Using alkaline extractionandhomogenisation(detergent-freemethods)ďd notprovide membranedomains separatedfromnon.raflphaseofplasmamembrane. Inadditiontovariousmarkerproteins,gradientdistributionsof GPCRs andtrimericG proteinGso, GqďGl lo', Gil,2a andGp wereanalysedaswell' Innon.deteÍgent prepaÍations,all monitoredproteinsco.localísedin gradientfractionsrepresenting35-4070 sucÍose.on theotherhand,appIicationof TritonX. l 00 enabledus to...

Závér Nďím cilem bylo isolovat frakci plasmatickémembránycharakterisovanoujako lipidové rafý (membránovédomény)a naléá míru asociace receptorůspřažených s trimemími G proteiny (GPCRs) s těmito membránoými strukturami. Pro separaci raftů jsme použilitři různépostupy- detergentovouextrakci,alkalickou preparacise sonikaci a mechanickouhomogenisaci.Zjistilijsme, žepouzeaplikace Tritonu X-l00 vedla k oddělení lipidových raftůod většinovémembrálové fáze.Pro charakterisacihustotníchsacharosov'ých gradientůzískaných z homogenáhr"alkalického čidetergentovéhoextraktu jsme použili celou řadu bílkovin vys\Áujících sepo centrifugaciv oblastechgradientuodpovidajicich sacharosámo nízké(15.25%)i lrysoké(40%)hustotě.Nizkohustotní,detergentresistentní membriínovéfragmený byly charakterisovány přítomnostíproteinůmembrrí'rrovýchdomén caveolinu,flotillinu a GPI vrizanýchalkalickéfosfatasy,cD55' cD58 a CD59, zatímco vysokohustotnígradientovéfrakce obsahovalypřevážnouvětšinuneraftov'ýchproteinůNďK- ATPasy, MHc I' cDl47' calnexinu a transferinovéhoreceptoru.Alkalická extrakceani homogenisacebuněčnéhomateriálunevedlak isolaci membránovýchdoménoddělenýchod nedoménovéfaze plasmatickémembrány. Kromě ruzrrých,'markerov.ých..proteinůjsme analysovalipředevšímgradientové distribucetrimerníchG proteinůGsa, Gqcr/Gl lo, Gil '2a' GB a...