Structure, activity and metabolism of human glutamate carboxypeptidase II

Abstract

ZAVER Nedávno publikované krystalové stÍuktuly GCPII poskytly náhled do organizace vazebné kapsy pro substrát a odhali|y něko|ik aminokyse|in, které se podílejína vazbě substrátu/inhibitoru vsl' místě enzymu. Abychom doplnili a rozšíři|istrukturní studie, vytvořili jsme QM/T\4M model GCPII v komplexu se substrátem, N.acetyl-aspartyl. glutamátem (NAAG). To nám umožnilo předpovědět dalšíaminokyseliny důleŽitépro vazbu substrátu. Využili jsme místně speciťrcké mutageneze. abychom odhalili vliv těchto jednotlivých aminokyselin na vazbu substÍátu/inhibitoru a na enzymovou aktivitu GCPII. Poěítačovýmodel komp|exu GCPIVNAAG společněs výsledky z místně specifické mutageneze, ukazuje žeaminokyse|iny v S1' místě (váaající glutarát) jsou nezbytné pro vysokou ďinitu substrátu nebo inhibitoru, zatímco, zbytky v s1 místě jsou více dťúežitépři přeměně substrátu a mohly by hrát nějakou roli v kata|ytickém mechanismu enzymu. Přestože QMA4M model nám umožni|předpovědět strukturu a interakce mezi substrátem a enzymem v Sl místě, komp|exní popis reakčníhomechanismu GCPII je zatím mimo rámec našich možností. V blízkébudoucnosti bychom se rádi dozvěděli víceinformací o katalytickém mechanismu GCPII. Chceme se zaměřit na Glu424' který je situovián v bezprostřední blízkosti zinkťr v aktivním místě a s největší pravděpodobností se...

CONCLUSIONS AND PERSPECTIVES Recentry reported crystal sructures of GCpII provide stucturar insight into the organization of the substrate binding cavity and highlight residues implicated in substrate / inhibitor binding in the sI site of the enzyme. To comprement and extend the s[ucturar studies, we constructed a QMzMM model of GCPII in complex with its substrate, N-aceýt. aspartyl-glutamate, which enabled us to pÍedict additional anrino acid residues interacting with the bound subsrate. and used site-directed mutagenesis to assess the contribution of individual residues for substrate ,/ inhibitor binding and enzymatic activity of GCpII. we prepared and characterized 12 GcpJ' mutants targeting the amino acids in the vicinity of substrate./inhibitor binding pockets. The experimental results suggest that residues (especiaily Arg210) in the sť site are critical for substrate./inhibitor binding, whereas the residues forming the sl pocket niight be more important for the .fine-tuning, of GCptr substrate specificity and appear to be relevant for substrate turnover and may play a role in the enzyme's mechanism of action. Even though the QIVýMM calculations of the NAAG binding mode in the GCPII active site enabled us to predict the structure and enzyme-substrate interactions in the sl binding site, the complete...