Příprava a biochemická charakterizace proteasového inhibitoru equistatinu

Abstract

Equistatin ze sasanky koňské (Actinia equina) obsahuje proteinovou doménu Eqd2, která inhibuje aspartátové peptidasy, ale dosud nebyla detailně charakterizována. Rekombinantní Eqd2 byl připraven v kvasinkovém expresním systému a byl navržen protokol pro jeho chromatografickou purifikaci. Pomocí fluorescenčního inhibičního testu byla určena inhibiční specifita Eqd2, která ukázala, že je vysoce selektivním inhibitorem peptidas typu katepsinu D a pepsinu z rodiny aspartátových peptidas A1. Dále byla pomocí gelové chromatografie analyzována tvorba komplexu Eqd2-peptidasa a oligomerizace Eqd2 v roztoku. Za účelem budoucí rentgenostrukturní analýzy Eqd2 byla provedena primární analýza krystalizačních podmínek. Tato práce přináší nové významné informace o Eqd2 jako unikátním typu přirozených inhibitorů aspartátových peptidas. Lze předpokládat, že určení interakčního mechanismu Eqd2 umožní navrhovat jeho syntetická mimetika pro regulaci medicinálně významných peptidas. Klíčová slova: peptidasové inhibitory, proteolytické enzymy, aktivita a inhibice enzymů, rekombinantní exprese, purifikace proteinů, krystalizace proteinů, equistatin

Equistatin from the sea anemone Actinia equina contains a protein domain Eqd2 which inhibits aspartic peptidases and has not been characterized in detail. Recombinant Eqd2 was produced in the yeast expression system, and a protocol for its chromatographic purification was designed. The inhibitory specificity of Eqd2 was determined using a fluorescence inhibition assay, showing that Eqd2 is a highly selective inhibitor of cathepsin D-like and pepsin-like aspartic peptidases of family A1. Furthermore, size exclusion chromatography was used to analyze the Eqd2-peptidase complex and Eqd2 oligomerization in solution. Initial screening of crystallization conditions for Eqd2 was performed towards its structural analysis. This work provides important new information about Eqd2 as a unique type of natural inhibitors of aspartic peptidases. Its interaction mechanism can be exploited in the development of synthetic mimetics for regulation of medically important peptidases. (In Czech) Key words: peptidase inhibitors, proteolytic enzymes, activity and inhibition of enzymes, recombinant expression, protein purification, protein crystallization, equistatin