Functional analysis of eIF3e subunit of human translation initiation factor 3 in living cells.

Abstract

3 Abstrakt Eukaryotický iniciační faktor 3 (eIF3) je významným hráčem zúčastňujícim se více kroků iniciace translace, která v konečném důsledku vede k vytvoření elongace-schopného 80S ribosómu. Se svými 13 podjednotkami (eIF3a - eIF3m) představuje najvětší a nejkomplexnější translační iniciační factor, který se skládá ze tří vzájemně popřepájených modulů (i - iii). Navzdory jeho bezesporné důležitosti, přínos jednotlivých podjednotek pro jeho struktúrní integritu a správnou funkci není plně proskúmaný. Bylo zjistěné, že eIF3e podjednotka je součásti oktamerního jadra lidského eIF3 komplexu a navyše bylo proukázané, že je komponentem molekulárního přemostění mezi 40S ribosomální podjednotkou a čepička- vazebným komplexem, čím tak napomáha vazbě mRNA na 43S preiniciační komplex. V této práci byl analyzovaný dopad siRNA navozenej zníženej exprese eIF3e podjednotky na integritu a funkci eIF3 v in vivo podmínkach. Znížení tvorby eIF3e, tzv. eIF3e knock-down (eIF3eK.D. ), vedlo k výraznýmu úbytku dalších 3 podjednotek (d, k a l), které spolu s podjednotkami c a e tvoří modul ii lidského eIF3 komplexu. Zvyšné moduly i (obsahujíci a, b, g a i) a iii (pozostávajíci z f, h a m) ostali sčásti spolu asociované pravděpodobně za pomoci eIF3c a ich vazebná afinita voči 40S podjednotce klesla. Navyše buňky s nedostatkem...

2 Abstract Eukaryotic initiation factor 3 (eIF3) is a critical player involved in many steps of translation initiation, which ultimately result in the formation of the elongation competent 80S ribosome. With its 13 subunits (eIF3a - eIF3m) it is the largest and the most complex translation initiation factor composed of three mutually interconnected modules (i - iii), however, the role of individual subunits involved in its structural integrity and proper function is not fully explored. The eIF3e subunit was shown to be a part of the human eIF3 structural core and to help in the mRNA recruitment to the 43S pre-initiation complex by forming a molecular bridge between the 40S ribosomal subunit and the mRNA cap-binding complex. In this study, we employed siRNA-directed downregulation of eIF3e in HeLa cells and analysed its impact on the overall eIF3 integrity and function in vivo. The eIF3e knock-down (eIF3eK.D. ) led to the severe reduction of protein amounts of other three subunits (eIF3d, k and l), which together with the subunit eIF3c and e form module ii of the eIF3 complex. Remaining module i (composed of a, b, g and i) and iii (containing f, h and m) stayed partially bound perhaps thanks to a bridging effect of eIF3c, and showed reduced binding efficiency towards the 40S subunit compared to control...