Optimalizace expresního systému HEK293 buněčné linie pomocí regulace buněčného cyklu a apoptózy

Abstract

Tranzientní transfekce savčích buněčných linií je známa jako užitečná technika pro přípravu rekombinantních proteinů, kterou lze získat miligramy až gramy proteinů za pouhé dva týdny od klonování odpovídající cDNA. Takto připravené nativní glykosylované proteiny mohou být využity pro různé účely v molekulární biologii, imunologii či farmaceutickém průmyslu, např. pro počáteční fáze preklinického výzkumu terapeutických proteinů. Jednou z nejvíce používaných hostitelských savčích buněčných linií je v tomto ohledu linie lidských embryonálních ledvinných buněk, kterou lze dobře kultivovat a snadno se chemicky transfekuje. Produkce proteinů v tranzientně transfekovaných lidských embryonálních ledvinných buňkách může být zvýšena celou řadou faktorů, např. koexpresí kyselého růstového faktoru fibroblastu či jeho přídavkem do kultivačního média, anebo koexpresí proteinů regulujících buněčný cyklus či apoptózu. Byl připraven expresní plazmid pTW5, do kterého byl následně vložen gen pro aFGF, regulátor buněčného cyklu p18, p21 či p27 (inhibitory cyklin-dependentních kináz) nebo inhibitor apoptózy bcl-2 či bcl-x. Tyto plazmidy byly využity k optimalizaci expresního systému buněčné linie HEK293T. Za pomoci modelových proteinů - zeleného fluorescenčního proteinu a sekretované alkalické fosfatázy - byl sledován...

Transient transfection of mammalian cell lines is an effective approach for recombinant protein production, which can provide milligrams to grams of proteins in two weeks from cloning of the corresponding cDNA. Native glycosylated proteins prepared via this approach can be used for various purposes in molecular biology, immunology or pharmaceutical industry, i.e. initial phase of pre-clinical therapeutic protein research. One of the most used mammalian host cell lines is the human embryonic kidney cell line, that can be easily cultivated and chemically transfected. The amount of proteins produced by transiently transfected human embryonic kidney cells can be enhanced by a whole range of factors, i.e. co-expression or direct addition of acidic fibroblast growth factor to the culture medium, co-expression of cell cycle regulating proteins or anti-apoptotic proteins. Expression plasmid pTW5 was prepared and further modified by gene insertion of aFGF, cell cycle regulator p18, p21 or p27 (cyclin-dependent kinase inhibitors) or apoptosis inhibitor bcl-2 or bcl-x. These plasmids were then used for optimization of HEK293T cell line expression system. The impact of every single regulator and their combinations, including hitherto undescribed effect of combination of cell cycle regulator and anti-apoptotic...