Heterologní exprese a izolace lidského cytochromu P450 1B1

Abstract

Cytochromy P450 tvoří superrodinu hemových enzymů, jejíž jednotliví zástupci se vyznačují velmi širokou substrátovou specifitou, tudíž dokáží odbourávat desítky až stovky různých substrátů, avšak s různou účinností a kinetikou. Mezi látky, jež jsou schopni zástupci superrodiny cytochromů P450 odbourávat, patří jak eobiotika, tak xenobiotika. U obratlovců se jedná o membránové enzymy vázané v endoplasmatickém retikulu, které se vyskytují ve zvýšené míře v celé řadě tkání, např. v kůži, ledvinách či plicích. Nejvíce a nejčastěji se ovšem vyskytují v játrech. Cytochrom P450 1B1 je inducibilní enzym, který se vyskytuje převážně v plicích a kůži. Jeho exprese je indukována převážně přítomností polycyklických aromatických uhlovodíků a dioxinů. Mezi xenobiotika degradovaná cytochromem P450 1B1 patří rovněž některé heterocyklické aminy. Enzymy superrodiny cytochromů P450 jsou taktéž zodpovědné za metabolickou aktivaci řady karcinogenů na reaktivní látky, jež participují na vzniku aduktů s DNA a zvyšují hladinu oxidačního stresu v buňce. Tato diplomová práce se zabývá (i) přípravou dvou forem expresních vektorů kódujících gen lidské formy cytochromu P450 1B1, (ii) heterologní expresí tohoto proteinu, (iii) jeho následnou izolací doplněnou v jednom případě o štěpení TEV proteasou a (iv) porovnáním aktivity...

Cytochromes P450 are heme enzymes with very broad substrate specificity, they can oxidize tens to hundreds of different substrates including both eobiotics and xenobiotics, but with varying efficiencies and kinetics. They are responsible for the metabolic activation of many carcinogens resulting in formation of reactive intermediates, these reactive species participate in the formation of DNA adducts and also increase of oxidative stress. Eukaryotic cytochromes P450 are membrane bound enzymes found mostly in the endoplasmic reticulum. In vertebrates, they are expressed in a variety of tissues mostly in the liver, but also in kidney, lung, skin and others. The cytochrome P450 1B1 is an inducible enzyme which occurs mainly in the lung and skin. Its expression is induced predominantly by the presence of polycyclic aromatic hydrocarbons, dioxins and heterocyclic amines. The human cytochromes P450 are typically obtained using heterologous expression and isolated as a C-terminally modified hexa-histaq constructs using immobilized metal affinity chromatography. This thesis focuses on effect of C-terminal modifications on activity of human cytochrome P450 1B1. First, the two expression vectors encoding the human form of cytochrome P450 1B1 were prepared, one contained a classical C-terminal hexa-histaq...