Štúdium medzimolekulových interakcií pomocou izotermálnej titračnej kalorimetrie

Abstract

Kalorimetrické metódy sa využívajú na štúdium mechanizmov regulácie a riadenia biologických procesov na molekulárnej úrovni. Izotermálna titračná kalorimetria sa používa na sledovanie tepelnej výmeny pri molekulových interakciách v prostredí s konštantnou teplotou, využívaná je najmä pre jej priamy prístup merania termodynamických parametrov spojených s formáciou komplexov. Štandardne sa metódou ITC skúmajú biochemické interakcie, ako sú interakcie typu proteín - proteín, proteín - ligand alebo enzým - substrát. Cieľom tejto práce bolo (I) osvojiť si prácu s nano izotermálnym titračným kalorimetrom, (II) pripraviť DNA- väzbovú doménu ľudského transkripčného faktoru FOXO4 (FOXO4-DBD) a (III) preskúmať termodynamické aspekty interakcie medzi FOXO4-DBD a dvojvláknovej molekuly DNA (dsDNA) obsahujúcej špecifický väzbový motív. Proteín FOXO4 je jedným zo štyroch zástupcov "O" podskupiny forkhead transkripčných faktorov FOXO, ktoré hrajú významnú rolu v mnohých bunkových procesoch, vrátane onkogenézy, alebo ochrany pred stresom a starnutím. Forkhead doména sa viaže na sekvenciu DNA obsahujúcu väzbový motív 5'-(A/C)AA(C/T)A-3' so stechiometriou 1:1. Výsledky tejto práce potvrdili, že DNA-väzbová doména FOXO4 viaže študovanú dsDNA s disociačnou konštantou KD = 3,58 · 10−7 mol·dm−3 . Okrem väzbovej afinity...

Calorimetric methods are used to studying the mechanism of regulation and control of biological processes at the molecular level. Isothermal titration calorimetry (ITC) is used for monitoring the heat exchange of molecular interactions in an environment with constant temperature. This method is also preferred because of its ability of direct measurement of thermodynamic parameters associated with complex formation. ITC measures mostly the energetics of biochemical reactions or molecular interactions protein-protein, protein-ligand, or enzyme-substrate. Main goals of this bachelor thesis were: (I) to acquire working skills with nano isothermal titration calorimeter; (II) to prepare the DNA-binding domain of human transcription factor FOXO4 (FOXO4-DBD); and (III) to study thermodynamic aspects of the interaction between FOXO4-DBD and the double-stranded DNA containing specific binding motif. FOXO4 protein is one of the four members of a "O" subgroup of forkhead transcription factors FOX, which play an important role in many cellular processes including stress resistance, age control and oncogenesis. Forkhead DNA- binding domain recognizes sequences containing the core motif 5'-(A/C)AA(C/T)A-3' with the binding stoichiometry 1:1. Results of this bachelor thesis show that FOXO4-DBD binds the...