Využití hmotnostně spektrometrických metod k tvorbě databáze biologických agens kompatibilní s evropským datovým systémem

Abstract

This PhD thesis applies MALDI-TOF mass spectrometry to identification of highly pathogenic bacteria. Three major topics were studied in this thesis. The aim of the first project was to propose a universal workflow of sample preparation method for the identification of highly virulent pathogenes by MALDI-TOF MS. Fifteen bacterial species, including highly virulent Gram-positive and Gram-negative bacteria were employed in the comparative study of four sample preparation methods compatible with MALDI-TOF MS. Based on the values of protein yield and spectral quality, the method using combination of ethanol treatment followed by extraction with formic acid and acetonitrile shows the highest extraction efficacy and the spectral quality with no detrimental effect caused by storage. Thus, this can be considered as a universal sample preparation method for the identification of highly virulent microorganisms by MALDI-TOF mass spectrometry. In the second part, a reference database of MALDI-TOF MS profiles of high risk pathogens, containing mass spectra of 392 strains belonging to 12 bacterial species, was created. The database was validated in international proficiency tests. Based on the validation studies, the use of the database for identification of high risk pathogens was accredited by Czech Institute for...

Předkládaná disertační práce je zaměřena na využití metody MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie pro identifikaci vysoce rizikových bakteriálních patogenů. V rámci disertační práce jsou řešeny celkem tři vědecké projekty. První část disertační práce je věnována nalezení optimálního protokolu přípravy vzorků k MALDI-TOF MS analýze vysoce virulentních bakterií. Na panelu 15 bakteriálních kmenů zahrnujících Gram-pozitivní i Gram-negativní druhy byla provedena srovnávací studie čtyř metod přípravy vzorků, kompatibilních s MALDI-TOF MS. V rámci studie byla porovnávána schopnost inaktivace vzorků bakteriálních kultur, výtěžnost bakteriálních proteinů a kvalita získaných hmotnostních spekter. Na základě výsledků bylo zjištěno, že nejvyššího výtěžku proteinů a optimální kvality spekter je dosaženo při použití metody založené na inaktivaci ethanolem v kombinaci s extrakcí kyselinou mravenčí a acetonitrilem. Druhý projekt byl zaměřen na tvorbu referenční databáze MALDI-TOF MS profilů vysoce rizikových patogenů. Za použití statistického zpracování změřených hmotnostních spekter byla vytvořena databáze, obsahující v současné době spektrální profily 392 kmenů 12 vysoce virulentních bakteriálních druhů. Databáze byla validována v mezinárodních srovnávacích testech, na základě výsledků validace byla metoda identifikace...