Analýza vlivu glykosylace na poskládání a molekulární architekturu enzymů

Abstract

V rámci zaměření naší laboratoře na studium vlivu glykosylace na proteinovou architekturu a biologickou aktivitu plísňových hexosaminidase jsem pro experimenty zvolila enzym z Penicillium oxalicum. Jeho hlavní výhodou je relativně homogenní glykosylace, propeptid tohoto enzymu je přirozeně glykosylovaný pouze na dvou místech, asparaginu 11 a serinu 66. Katalytická podjednotka a propeptid enzymu hexosaminidasy z Aspergillus oryzae byly pro rekonstituční experimenty odděleny od sebe. Cílenou mutagenesí byly v propeptidové části enzymu izolovaného z Penicillium oxalicum vyměněny asparagin 11 a serin 66 za cystein vhodný ke glykosylaci. Velkou nadějí pro účinné navrácení (rekonstituci) enzymové aktivity představoval nově syntetizovaný propeptidový derivát celobiosy, který je nejvíce podobný přirozeně se vyskytujícímu cukru chitobiose. Glykosylovaný propeptid byl oddělen od neglykosylovaného. Pomocí rekonstitučních experimentů jsme zjišťovali vliv glykosylace na enzymovou strukturu a aktivitu s využitím různě glykosylovaných propeptidů. Největší účinnost nastala při rekonstituci s původním propeptidem. V dalších pokusech byly zahrnuty kombinace synteticky glykosylovaných propeptidů, z nichž největší účinnost měla celobiosa (Asn11 ) - manosa (Ser66 ) a N-acetylglukosamin (Asn11 ) - manosa(Ser66 )....

Our laboratory studies the influence of glycosylation on protein architecture and the biological activity of fungal hexosaminidases. I studied the enzyme from Penicillium oxalicum which has an advantage of quite a homogenous glycosylation. The propeptide of this enzyme is naturally glycosylated only at two places - asparagine 11 and serine 66. Catalytic subunit and propeptide of the hexosaminidase enzyme from Aspergillus oryzae were separated from each other for reconstitution experiments. In the propeptide part of the enzyme separated from the Penicillium oxalicum hexosaminidase, asparagine 11 and serine 66 were swapped for cysteine by targeted mutagenesis. The newly synthesized propeptide modified with cellobiose, which is a compound most similar to naturally occurrency saccharide chitobiose, promised a significant chance of restoration of enzyme activity. The glycosylated propeptide was separated from the nonglycosylated. In reconstitution experiments we observed the influence of glycosylation on the enzyme structure and activity using different glycosylated propeptides. The highest efficiency occurred during the reconstitution by the original propeptide. Next we used combinations of artificially glycosylated propeptides of which the highest reconstitution efficiency had cellobiose(Asn11...