Application of molecular and cellular biology methods in research of protozoa Eimeria

Abstract

Eimeria is an apicomplexan parasite causing disease coccidiosis that is most prominent in poultry farming industry. This thesis is aimed to develop new molecular tools and resolve issues that would be a valuable contribution in the field from both research and industry perspective. Because immunity to Eimeria is strictly species- specific, it is important to know and recognize correctly all species that parasitize the host. Traditional diagnostic approaches rely on classical methods such as oocyst morphology determination under the microscope, measurement of prepatent period or in-vivo assessment of lesions caused by this parasite. However, diagnostics of individual species using these methods is very time-consuming and it is often unreliable, especially when mixture of multiple species whose parameters overlap is analyzed. Methods utilizing conventional PCR to distinguish species already exist, however, they lack advantages offered by quantitative real-time PCR (qPCR). The first aim of this thesis was to develop qPCR assays for detection and quantification of seven Eimeria species which infect chicken utilizing single-copy non-polymorphic targets in order to ensure maximal specifity and coverage of all strains of each species. Usefulness of this method was demonstrated by analysis of field...

Eimerie jsou jednobuněční prvoci z kmene Apicomplexa způsobující nemoc kokcidiózu, která je příčinou velkých ekonomických ztrát především v drůbežářském průmyslu. Cílem této práce bylo vyvinout nové molekulární metody a vyřešit některé problémy, což by bylo cenným příspěvkem v oboru, využitelným jak ve výzkumu tak i v praxi. Protože imunita proti eimeriím je druhově přísně specifická, je důležité znát jednotlivé druhy a dokázat je rozpoznávat. Tradiční diagnostické postupy spoléhají na klasické metody jako je určování morfologie oocyst pod mikroskopem, stanovování prepatentní periody nebo hodnocení lézí způsobených parazitem. Určování druhů těmito způsoby je však časově velice náročné a často nespolehlivé, hlavně v případech, kdy analyzujeme směs více druhů, jejichž parametry se překrývají. I když metody určování druhů využívající klasickou PCR již existují, tyto metody postrádají výhody nabízené real-time kvantitativní PCR (qPCR). Prvním cílem této práce bylo vyvinout qPCR metody pro detekci a kvantifikaci sedmi druhů kuřecích eimerií. Cílem byla vysoká specifita a maximální pokrytí všech různých kmenů každého druhu, proto byly jako cílové sekvence hledány jednokopiové nepolymorfní oblasti. Užitečnost metody byla demonstrována analýzou vzorků z terénu. Dalším cílem práce bylo vyřešení postavení...