Rekombinantní cysteinové peptidasy klíšťat

Abstract

Recombinant cysteine peptidases of Ixodes ricinus Jindřich Srba Abstract Intracellular proteolysis of ingested blood proteins is a crucial physiological process in ticks. In a tick, Ixodes ricinus, cysteine proteases, cathepsins B and L, are part of a gut-associated multi-peptidase complex. This thesis deals with preparation of recombinant procathepsins B and L and characterization of functional and biochemical properties of cathepsins B and L. After expression procathepsins B and L in E. coli and their purification from inclusion bodies by affinity chromatography, the basic strategy was searched that would enable to achieve successful refolding. A suitable type in both cases showed to be "basic" refolding. Both refolded procathepsins were auto-activated in the acidic environment of pH 4,0; cathepsin B (but not cathepsin L) also at pH 5,5. Activity was determined at pH dependence substrate specificity and inhibition. The pH optimums for hydrolytic activity of cathepsins B and L were in the range of 4,5 - 5,5 and 3,0 - 3,5, respectively. Both enzymes were blocked by an inhibitor of cysteine peptidase group and each of them by specific inhibitors designed for mammalian cathepsins B and L. The results of this thesis show that cathepsins B and L produced in the gut I. ricinus exhibit exo- and endo-peptidase...

Rekombinantní cysteinové peptidasy klíšťat Jindřich Srba Abstrakt Intracelulární proteolýza krevních proteinů je zásadním fyziologickým procesem u klíšťat. U klíštěte Ixodes ricinus jsou cysteinové peptidasy, katepsiny B a L, součástí multi-peptidasového komplexu střev. Tato diplomová práce se zabývá přípravou rekombinatních prokatepsinů B a L a charakteristikou funkčních a biochemických vlastností katepsinů B a L. Po expresi prokatepsinů B a L v E. coli a jejich purifikaci z inkluzních tělísek afinitní chromatografií se hledala základní strategie, která by umožnila dosáhnout úspěšného refoldingu. Vhodným typem refoldingu se ukázal pro oba studované prokatepsiny "bazický" refolding. Oba prokatepsiny byly auto-aktivovány v kyselém prostředí pH 4,0; katepsin B (nikoli katepsin L) také při pH 5,5. Byla určena závislost aktivity na pH, substrátová a inhibiční specificita. Optimální pH pro hydrolytickou aktivitu katepsinů B a L byla v rozmezí 4,5 - 5,5 a 3,0 - 3,5. Oba enzymy byly blokovány skupinovým inhibitorem cysteinových peptidas a každý z nich specifickým inhibitorem navrženým pro savčí katepsiny B a L. Výsledky této diplomové práce ukazují, že katepsiny B a L produkované ve střevě klíštěte I. Ricinus vykazují výraznou exo- resp. endo-petidasovou aktivitu, což potvrzuje jejich předpokládanou úlohu v...