The effects of long double-stranded RNA expression in mammalian cells.

Abstract

Double stranded RNA (dsRNA) is a foreign molecule that arises in the cell either as a by-product of viral replication or it is produced by the intramolecular or intermolecular pairing of complementary RNAs, often originating from repetitive sequences. In mammals, dsRNA can enter one of three pathways: the sequence-specific RNA silencing, the sequence-independent interferon (IFN) response, or editing by adenosine deaminases. The main focus of my PhD project was to comprehensively analyze the effects of the expressed dsRNA in mammals in the context of the whole organism. To follow this aim, we generated a construct expressing dsRNA in a form of an mRNA containing a long perfect hairpin structure. Transgenic mice ubiquitously expressing dsRNA were viable and, in contrast to the previous studies, the IFN response was not activated. In somatic cells, dsRNA was poorly processed into small interfering RNAs, did not cause transcriptional silencing in trans, and underwent low adenosine deamination without the nuclear retention. Consistent results were obtained in human cells transiently transfected with a dsRNA-expressing plasmid. On the other hand, dsRNA expression caused robust RNA interference (RNAi) in oocytes. Thus, we show for the first time that expressed dsRNA, in contrast to many other forms of...

Dvouvláknová RNA je cizorodá molekula, která se objevuje v buňce buď jako produkt replikace viru nebo vzniká párováním komplementárních RNA, a to v rámci jedné molekuly nebo mezi dvěma molekulami. Komplementární RNA často pocházejí z repetitivních sekvencí. U savců může dvouvláknová RNA vstupovat do jedné ze tří drah: sekvenčně specifického umlčování RNA (RNA silencing), sekvenčně nezávislé interferonové (IFN) odpovědi nebo editace pomocí adenosin deamináz. Hlavním zaměřením mého PhD projektu bylo detailně zanalyzovat efekty dvouvláknové RNA produkované v savčích buňkách, a to v rámci celého organismu. Za tímto účelem jsme vytvořili konstrukt exprimující dvouvláknovou RNA ve formě mRNA, obsahující dlouhou a perfektně párující vlásenkovitou strukturu. Transgenní myši, vytvářející dvouvláknovou RNA ve všech buňkách, byly životaschopné a, na rozdíl od výsledků dosavadních studií, neměly aktivovanou IFN odpověď. V somatických buňkách byla dvouvláknová RNA jen málo štěpena na krátké interferující RNA (siRNA), nezpůsobovala transkripční umlčování v trans a docházelo k mírné deaminaci adenosinu bez zadržování editované RNA v jádře. Shodné výsledky jsme získali v savčích buňkách, které byly tranzientně transfekovány plazmidem exprimujícím dvouvláknovou RNA. Naproti tomu ve vajíčcích způsobovala...