Příprava neuroaktivních steroidů pro studium NMDA receptorů

Abstract

Neurosteroidy jsou významnou skupinou látek ovlivňujících vzájemnou komunikaci nervových buněk. Podstatou jejich působení je rychlá alosterická modulace membránových receptorů pro přenašeče nervového signálu. Jedním z nejdůležitějších systémů ovlivňovaných neurosteroidy je NMDA receptor. Vazebné místo pro inhibiční steroidy na něm nebylo dosud nalezeno. Předkládaná práce je zaměřena na přípravu fluorescenčně značené fotoafinitní sondy, která může pomoci objasnit strukturu a umístění vazebného místa, a tím usnadnit nalezení účinných neuroprotektiv. Byl připraven (20S)-20-Aido-5β-pregnan-3α-yl N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole- 4-yl)-L-glutamyl 1-ester (8), jehož základní struktura napodobuje endogenní neurosteroid, dále obsahuje fotolabilní azidoskupinu a kovalentně vázanou fluorescenční NBD část. Kromě zmíněného pregnanového derivátu byla syntetizována i další fotoafinitní sonda s modifikovaným steroidním skeletem - pyridinium 17aα-azido-17α-methyl-17a-homo-5β- androstan-3α-yl 3-sulfát (29). Na buňkách z linie HEK293 exprimující NMDA receptory o podjednotkovém složení NR1-1a/NR2B bylo metodou terčíkového zámku ověřeno, že oba připravené deriváty si zachovaly schopnost endogenního neurosteroidu inhibovat aktivovaný NMDA receptor. V experimentálním systému buněčné linie HEK293 byly stanoveny hodnoty...

Neurosteroids are an important group of substances that affect communication between neurons. They act as allosteric modulators of membrane receptors for neurotransmitters. One of the most important systems influenced by neurosteroids are NMDA receptors; however, a binding site(s) for their inhibition by steroids have not been found yet. This work is focused on the synthesis of fluorescently labeled photoaffinity probe, which may help explain the structure and location of binding site(s) and simplify the development of new neuroprotectives. A structural analogue of the endogenous neurosteroid, (20S)-20-Azido-5β-pregnan- 3α-yl N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole-4-yl)-L-glutamyl 1-ester (8), was prepared. The structure of compound 8 includes photolabile azido group, as well as covalently bounded fluorescent NBD group. In addition, a photoaffinity probe with a modified steroid skeleton - pyridinium 17aα-azido-17α-methyl-17a-homo-5β-androstan-3α-yl 3-sulfate (29) - was synthesized. The ability of compound 8 and 29 to inhibit activated NMDA receptor has been verified for recombinant NR1-1a/NR2B receptors expressed in HEK293 cells using a patch-clamp technique. Additionally, the IC50 values of compounds 8 and 29 have been calculated. (In Czech) Key words: neuroactive steroid, NMDA receptor, photoffinity...