Syntéza fluorescenčně značených sond a jejich využití při vývoji inhibitorů methyltransferáz

Abstract

Methyltransferases (MTases) are enzymes that catalyze the transfer of a methyl group to various substrates and play a key role in the regulation of many biological processes. Dysregulation of their activity has been associated with the development of a range of diseases, including cancer, which makes them attractive targets for the development of new therapeutics. This thesis focuses on the development of fluorescent probes derived from S-adenosyl- L-homocysteine (SAH) as tools for studying MTase activity and for potential use in high-throughput screening (HTS) for the future development of possible MTase inhibitors. New fluorescence polarization (FP) probes were designed and synthesized, specifically SAH derivatives bearing a fluorescent label at the 2'- or 3'-OH group of the ribose moiety. These probes were subsequently evaluated in binding assays against selected MTases and assessed based on their KD values and applicability in competitive binding assays. Initial testing showed that probe 2b, bearing a cyanine 5 (Cy5) label attached to the 3'-OH position, exhibited strong affinity toward the MTase EHMT1 (KD = 30 nM). This probe was therefore further evaluated in a competitive binding assay, in which the inhibitory concentration IC50 was determined for selected inhibitors. The results...

Methyltransferázy (MTázy) jsou enzymy katalyzující přenos methylové skupiny na různé substráty a hrají klíčovou roli v regulaci mnoha biologických procesů. Dysregulace jejich aktivity je spojována s rozvojem řady onemocnění, včetně nádorových, což z nich činí atraktivní cíle pro vývoj nových terapeutik. Tato práce se zaměřuje na vývoj fluorescenčních sond odvozených od S-adenosyl-L-homocysteinu (SAH) jako nástrojů pro studium aktivity MTáz a pro potenciální využití ve vysokokapacitním testování (HTS, z ang. High-Throughput screening) pro budoucí vývoj možných inhibitorů MTáz. Byly navrženy a syntetizovány nové sondy pro fluorescenční polarizaci (FP), konkrétně deriváty SAHu s fluorescenční značkou na 2'- nebo 3'-OH ribózy. Tyto sondy byly následně podrobeny vazebné eseji vůči vybraným MTázám a hodnoceny na základě hodnot KD a využitelnosti pro kompetitivní vazebné eseje. Prvotním testováním bylo zjištěno, že sonda 2b s cyanin 5 (Cy5) značkou navázanou na 3'- OH části vykazuje silnou afinitu vůči MTáze EHMT1 (KD = 30 nM). Tato sonda byla proto podrobena kompetitivní vazebné eseji, v níž byla stanovena inhibiční koncentrace IC50 vůči vybraným inhibitorům. Výsledky prokázaly, že sonda 2b vykazuje výborné vazebné vlastnosti a představuje slibný nástroj pro budoucí testování inhibitorů EHMT1. Klíčová...