Studium proteinové struktury a interakcí s využitím nekanonických aminokyselin a strukturně-funkční proteomiky (model: lidský kalmodulin)

Abstract

Structural-functional proteomics represents a methodological approach aimed at the detailed characterization of protein function and spatial coordination. The XL-MS method (crosslinking mass spectrometry) is one of these experimental approaches, used, among other purposes, to study protein conformational dynamics and functional properties, as well as their complexes. The introduction of noncanonical amino acids featuring specific functional groups into protein sequence allows expanded possibilities for reactions with crosslinking agents, thus increasing the resolution and application potential of XL-MS. Calmodulin, a protein exhibiting two distinct conformational states depending on Caš⁺ ion binding, was chosen as a model system. Using the auxotrophic strain Escherichia coli B834 (DE3), wild-type calmodulin was expressed in nutrient-rich medium, and calmodulin incorporating azidohomoalanine (AHA), a structural analogue of methionine, was expressed in two minimal media (LM9 or DMEM). Purification was carried out employing two steps: after obtaining the cell lysate, conformation- dependent hydrophobic interaction chromatography was applied, followed by gel filtration. The obtained yields were 2.00 mg of wild-type calmodulin protein from 400 ml of nutrient- rich LB medium, compared to 0.12 mg of...

Strukturně-funkční proteomika představuje metodologický přístup zaměřený na detailní charakterizaci funkce a prostorového uspořádání proteinů. Metoda XL-MS (z angl. crosslinking mass spectrometry) je jedním z těchto experimentálních přístupů využívaných mimo jiné ke studiu dynamiky konformace a funkčních vlastností proteinů či jejich komplexů. Zavedení nekanonických aminokyselin do sekvence proteinu nesoucích specifické funkční skupiny umožňuje rozšíření možností pro reakci se síťovacími činidly, čímž lze zvýšit rozlišovací schopnost a aplikační potenciál XL-MS. Kalmodulin, protein vykazující dva výrazně odlišné konformační stavy v závislosti na vazbě iontů Caš⁺, byl zvolen jako modelový systém. Pomocí auxotrofního kmene Escherichia coli B834 (DE3) byl exprimován přirozený protein, kalmodulin, v nutričně bohatém médiu a kalmodulin s inkorporovaným azidohomoalaninem (AHA), strukturním analogem methioninu, ve dvou limitních médiích (LM9 a DMEM). Purifikace proběhla ve dvou krocích: po získání buněčného lyzátu byla využita konformačně podmíněná hydrofobní interakční chromatografie s následnou gelovou filtrací. Získané výtěžky dosahovaly 2,00 mg přirozeného proteinu kalmodulinu z 400 ml nutričně bohatého média LB oproti 0,12 mg kalmodulinu s AHA z 500 ml LM9 a 0,005 mg z 450 ml DMEM. Následně byly...