Enzymatic Preparation of New Cyclic Dinucleotide Analogs and Their Effect on cGAS-STING Signaling Cascade

Abstract

Signální dráha cGAS (syntáza cyklického guanosin-adenosin monofosfátu) - STING (Stimulátor interferonových genů) hraje klíčovou roli ve vrozené imunitní odpovědi proti patogenům a v dohledu nad nádorovými buňkami. Cyklické dinukleotidy (CDN) jsou klíčovými mediátory této signální dráhy, jež slouží jako druzí poslové aktivující protein STING. Terapeutické cílení této signální dráhy má významný potenciál pro léčbu různých nemocí, včetně rakoviny a virových infekcí. Tato disertační práce se zaměřuje na enzymatickou syntézu nových analogů cyklických dinukleotidů a hodnotí jejich dopad na signální dráhu cGAS-STING. I když je enzymatická syntéza částečně limitována substrátovou specificitou použitého enzymu, jeví se jako efektivní alternativa klasické organické syntézy CDN, a to zejména z časového a ekonomického hlediska. Za použití různých druhů CDN syntáz a naší malé knihovny přírodních a modifikovaných substrátů nukleozidových trifosfátů jsme úspěšně připravili nové analogy CDN in vitro. Podle výsledků testování substrátové specificity CDN syntáz jsme vybrali nejvšestrannější enzymy: eukaryotickou syntázu cyklického guanosin-adenosin monofosfátu cGAS a dvě CDN syntázy bakteriálního původu, dinukleotid cyklázu DncV a diadenylát cyklázu btDisA. Pomocí těchto CDN syntáz jsme enzymaticky syntetizovali...

The cyclic guanosine-adenosine monophosphate synthase (cGAS) - stimulator of interferon genes (STING) signaling pathway plays a critical role in the innate immune response against pathogens and surveillance of tumor cells. Cyclic dinucleotides (CDNs) are key mediators within this pathway, serving as second messengers to activate STING. Targeting this pathway holds significant therapeutic potential for various diseases, including cancer and viral infections. This dissertation focuses on the enzymatic synthesis of novel CDN analogs and evaluates their impact on the cGAS-STING signaling pathway. Although partially limited by substrate specificity of the enzyme used, the enzymatic approach is a time- and cost-effective alternative to the classical organic synthesis of CDNs. We successfully generated novel CDN analogs employing various CDN synthases and a library of natural and modified nucleotide triphosphate substrates in vitro. Substrate specificity screening allowed us to select the most versatile enzymes: eukaryotic cyclic guanosine-adenosine monophosphate (cGAMP) synthase cGAS and dinucleotide cyclase DncV and diadenylate cyclase btDisA of bacterial origin. With their use we enzymatically synthesized over 300 novel CDN analogs, 57 of which are further analyzed and presented in this work....