Detailní enzymová charakterizace modelového zástupce hemových kyslíkových senzorů

Abstract

This thesis focuses on heme-based gas sensors, particularly phosphodiesterase from the bacterium Escherichia coli, referred to as EcDOS. The enzyme catalyzes the degradation of c-di-GMP, an important signaling molecule in bacteria that affects cellular processes, such as bacterial motility or biofilm formation. The thesis deals with detailed enzyme kinetics of protein forms in different redox and ligand states of the heme iron ion [Fe(III), Fe(II) and Fe(II)-O2], as well as a mutant form of the enzyme (EcDOS H77A) which does not bind heme. Results confirmed that the EcDOS WT Fe(II)-O2 form has higher kcat values than the EcDOS form with the ferrous ion of heme in the reduced state. Other significant result was that the enzyme activity is affected not only by the state of the heme iron ion but also by the presence and concentrations of divalent metal cations. The presence of the metal cation is essential for enzyme function, and suitable metal ions that stimulate enzyme activity are Mg2+ , Mn2+ and Zn2+ or their mixtures, which act synergistically on enzyme activity under chosen conditions. Analysis by ICP-MS also showed that Zn2+ cations are natural components of the enzyme. Thus, for further kinetic studies, it would be appropriate to use Zn2+ or mixtures of metal ions that are physiological for...

Tato práce je zaměřena na hemové senzorové proteiny detekující kyslík, zejména na fosfodiesterasu z bakterie Escherichia coli, označovanou jako EcDOS. Tento enzym katalyzuje degradaci c-di-GMP, což je důležitá signální molekula bakterií, jež má vliv na určité buněčné pochody, např. na pohyblivost bakterií nebo tvorbu biofilmů. Práce se zabývá detailní enzymovou kinetikou forem proteinu v různých redoxních a ligandových stavech iontu železa hemu [Fe(III), Fe(II) a Fe(II)-O2] a věnuje se také mutantní formě tohoto enzymu (EcDOS H77A), která neváže hem. Jedním z výsledků práce bylo potvrzení toho, že forma EcDOS WT Fe(II)-O2 vykazuje vyšší hodnoty kcat než forma EcDOS s iontem železa hemu v redukovaném stavu. Překvapením bylo zjištění, že aktivita enzymu je ovlivněna nejen stavem iontu železa hemu, ale i přítomnými dvojmocnými kationty kovů a jejich koncentracemi. Přítomnost kationtu kovu je pro funkci enzymu esenciální a vhodnými ionty kovů, které stimulují enzymovou aktivitu, jsou Mg2+ , Mn2+ a Zn2+ nebo jejich směsi, jež působí na aktivitu enzymu za zvolených podmínek synergicky. Analýza pomocí ICP-MS také prokázala, že kationty Zn2+ jsou přirozenou součástí enzymu. Tudíž by pro další kinetické studie bylo vhodné využít Zn2+ nebo směsi iontů kovů, které jsou fyziologické pro E. coli, z níž EcDOS...