Klonování, exprese a charakterizace virových proteinů

Abstract

Over the last twenty years three new coronavirus strains have appeared in human population, that cause dangerous infections of respiratory tract. At this moment no approved drug exists, that could mitigate the infection caused by these viruses. One of the possible targets of these drugs are proteins responsible for viral genome replication. Nsp13 is primarily a helicase, that unwinds double stranded nucleic acids in the direction of 5'-3', but it also increases activity of replication and transcription complex, it participates in the synthesis of 5' cap on viral RNA and it probably mediates the backtracking of replication and transcripton complex during the process of RNA repair. On top of that nsp13 is strongly conserved among all coronaviruses and it is possible target not only for COVID-19 treatment, but also infections caused by potential future coronaviruses. Theoretical part of the thesis briefly describes the life cycle of SARS-CoV-2, functions of individual proteins of this virus, that participate in replication and transcription of RNA and it summarizes current knowledge about function of nsp13 and its potential inhibitors. In experimental part we have prepared the expression vector for nsp13, that was used for the production of nsp13. Nsp13 was then isolated and purified. (In Czech) Key...

Za posledních dvacet let se v lidské populaci objevily tři nové druhy koronavirů, které jsou původci nebezpečných infekcí respiračních cest. Momentálně neexistuje žádné schválené léčivo, které by dokázalo zmírnit průběh infekcí způsobených těmito viry. Jedním z možných cílů těchto léčiv jsou proteiny zodpovědné za replikaci virového genomu. Nsp13 je primárně helikasa rozplétající dvouřetězcové nukleové kyseliny ve směru 5'-3', ale také zvyšuje aktivitu replikačního a transkripčního komplexu, podílí se na syntéze 5' čepičky na virové RNA a pravděpodobně zprostředkovává posun replikačního a transkripčního komplexu do opačného směru transkripce (backtracking) během procesu opravy RNA. Navíc nsp13 je velmi konzervován napříč všemi koronaviry, a proto je možným cílem nejen pro léčbu COVID-19, ale i infekcím způsobeným potenciálními koronaviry v budoucnosti. V teoretické části této práce je stručně popsán životní cyklus SARS-CoV-2, funkce jednotlivých proteinů tohoto viru podílejících se na replikaci a transkripci RNA a jsou shrnuty dosavadní vědomosti ohledně funkce nsp13 a jeho potenciálních inhibitorů. V experimentální části byl připraven expresní vektor pro nsp13, který byl následně použit k transformaci bakterií a produkci rekombinantní nsp13. Nsp13 byl následně izolován a purifikován. Klíčová...