Dynamika degradace hodinového proteinu PER2 pomocí detekce bioluminiscence v reálném čase ve tkáňovém explantátu cirkadiánních hodin mPER2Luc myši

Abstract

Hlavním oscilátorem cirkadiánních rytmů jsou suprachiasmatická jádra. Pomocí hodinových genů a jejich proteinových produktů (tvořících zpětnovazebné transkripčně- translační smyčky) představují významnou roli v řízení mnoha tělesných funkcích. Díky metodě využívající transgenní organismy byla měřena bioluminiscence, potažmo množství hodinového proteinu PER2. V této práci byl využit cykloheximid k inhibici proteosyntézy a k následnému sledování degradace tohoto hodinového proteinu v reálném čase. Protein byl měřen v explantátech suprachiasmatických jader dospělých myší, v suprachiasmatických jádrech fétů a v placentách. Dále byly porovnávány vlivy inhibitorů glykogensyntasykinasy 3b na dynamiku degradace proteinu PER2. Využit byl selektivní inhibitor CHIR-99021 a nespecifický inhibitor chlorid lithný. Z experimentu vyplývá, že inhibitor CHIR degradaci proteinu zpomaluje, a to ve všech použitých tkáních. Oproti tomu vliv nespecifického inhibitoru chloridu lithného nebyl jednoznačně určen. U fetálních jader byl jeho vliv na dynamiku degradace zpomalující, zatímco u dospělých jader byla degradace výrazně zrychlována. U explantátů placent nebyly pozorovány signifikantní výsledky. Výzkumy, zaměřující se na ovlivnění těchto hodinových genů, resp. jejich proteinů, by v budoucnu mohly být využity k...

Suprachiasmatic nuclei are the main oscillator of circadian rhythms. Using clock genes and their protein products (forming transcription-translation feedback loops), suprachiasmatic nuclei play an important role in the control of many physiological functions. Bioluminescence (the amount of hourly protein PER2) was measured by a method using transgenic organisms. In this work, cycloheximide was used to inhibit proteosynthesis and to subsequently monitor the degradation of PER2 in real time. The protein was then measured in explants of suprachiasmatic nuclei of adult mice, in suprachiasmatic nuclei of fetuses and in placentas. Furthermore, the effects of glycogen synthasykinase 3b inhibitors on the dynamics of PER2 protein degradation were compared. A selective inhibitor CHIR-99021 and a non-specific inhibitor lithium chloride were used. The experiment shows that the CHIR inhibitor slows down protein degradation in all tissues used. In contrast, the effect of a non-specific lithium chloride inhibitor has not been clearly demonstrated. In fetal nuclei, its effect on the dynamics of degradation was slowing, while in adult nuclei, degradation was significantly accelerated. No significant results were observed in placental explants. Research focusing on the influence of these clock genes, respectively...