Effect of amino acid alphabet reduction on structure and function of dephosphocoenzyme A kinase

Abstract

Je dobře známo, že velká rozmanitost proteinových funkcí a struktur je umožněna širokým spektrem fyzikálně-chemických vlastností 20 standardních aminokyselin, které tvoří moderní proteiny. Podle obecně přijímané koevoluční teorie genetického kódu, evoluce proteinových struktur a funkcí byla nepřetržitě spojena s rozšiřováním genetického kódu, přičemž aromatické aminokyseliny jsou považovány za nejvíce pozdní členy genetického kódu. Jejich inkorporace zřejmě přispěla ke zvýšení strukturní stability proteinů a diverzifikaci jejich katalických funkcí. Hlavním cílem této diplomové práce bylo otestovat, zda enzymová katalýza mohla předcházet inkorporaci aromatických aminokyselin do standardního genetického kódu. Pro tento účel byl prozkoumán vliv redukce aminokyselinového repertoáru na strukturu a funkci defosfokoenzym A kinasy (DPCK). Defosfokoenzym A kinasa katalyzuje poslední krok v biosyntéze koenzymu A, což je evolučně vysoce konzervovaný kofaktor. V této práci byly navrženy dva mutantní proteiny DPCK z termofilní bakterie, Aquifex aeolicus, tak, aby aromatické aminokyseliny byly nahrazeny (i) leuciny a (ii) nearomatickými aminokyselinami pro co největší zachování strukturní stability proteinu. Přirozená varianta (z angl. wild type) proteinu a dva mutantní proteiny postrádající aromatické...

It is well-known that the large diversity of protein functions and structures derives from the broad spectrum of physicochemical properties of the 20 canonical amino acids that constitute modern proteins. According to the generally accepted coevolution theory of the genetic code, evolution of protein structures and functions was continuously associated with enrichment of the genetic code, with aromatic amino acids being considered the latest addition to the genetic code to increase structural stability of proteins and diversification of their catalytic functions. The main objective of this master thesis was to test whether enzymatic catalysis could precede the appearance of aromatic amino acids in the standard genetic code. For that purpose, the effect of amino acid alphabet reduction on structure and function of dephosphocoenzyme A kinase (DPCK) was studied. Dephosphocoenzyme A kinase catalyses the final step in the biosynthesis of coenzyme A, a very conserved cofactor. Two aromatic amino acid-lacking mutants of DPCK from a thermophilic bacterium, Aquifex aeolicus, were designed by substituting aromatic amino acid residues by (i) leucines and (ii) various non-aromatic amino acids to best preserve the structural stability of the protein. Wild type protein and the two mutants were cloned and...