Inženýrství mikrobiálních glykosidáz pro změnu syntetického potenciálu

Abstract

Glycosidases (EC 3.2.1.) alias glycoside hydrolases are enzymes that catalyze the cleavage of a glycosidic bond between two carbohydrates or between a carbohydrate and an aglycone. Under suitable conditions (especially reduction of water activity in the reaction mixture), these enzymes are also able to synthesize a glycosidic bond. By targeted mutagenesis of the catalytic centre of the enzymes, it is possible to suppress or completely abolish their hydrolytic activity. Enzyme synthesis using glycosidases makes it possible to prepare bioactive galactosides, for example galectin ligands. The present work deals mainly with β-galactosidase from Bacillus circulans, its recombinant expression and mutagenesis. In the first part of the work, the commercially prepared plasmid of -galactosidase from B. circulans isoform A that I designed was used for recombinant expression in E. coli. It was necessary to optimize the conditions of the enzyme production. As it is a large protein (189 kDa), the expression vector pCOLD II and cold production at 15 ř C were used. The enzyme is specific for the formation of the β-1,4 glycosidic bond and has been used to synthesize complex tri- and tetrasaccharide ligands that cannot be prepared with a crude commercial preparation containing undesirable enzyme activities....

Glykosidázy (EC 3.2.1.) neboli glykosidhydrolázy jsou enzymy katalyzující štěpení glykosidové vazby mezi dvěma sacharidy nebo mezi sacharidem a aglykonem. Za vhodných reakčních podmínek (zvláště snížení aktivity vody v reakční směsi) jsou tyto enzymy schopné glykosidovou vazbu též syntetizovat. Cílenou mutagenezí katalytického centra enzymů je možné potlačit nebo úplně zrušit jejich hydrolytickou aktivitu. Enzymová syntéza pomocí glykosidáz umožňuje připravit bioaktivní galaktosidy, např. ligandy galektinů. Předkládaná práce se zabývá zejména -galaktosidázou z Bacillus circulans, její rekombinantní expresí a mutagenezí. V první části práce byl mnou navržený komerčně připravený plazmid -galaktosidázy z B. circulans izoformy A použit k rekombinantní expresi v E. coli. Bylo nutné optimalizovat podmínky produkce enzymu. Jelikož jde o velký protein (189 kDa) byl použit expresní vektor pCOLD II a chladová kultivace při 15 řC. Enzym je specifický pro tvorbu glykosidové vazby β-1,4 a byl využit na syntézu komplexních tri- a tetrasacharidových ligandů, které nelze připravit s hrubým komerčním preparátem obsahujícím nežádoucí enzymové aktivity. Dále byla pomocí PCR s mutantními primery provedena cílená mutageneze katalytického nukleofilu v aktivním centru tohoto enzymu, čímž byl vytvořen mutant v pozici...