Molekulární mechanismus regulace opravné dráhy Fanconiho anémie fosforylací proteinu FANCI

Abstract

Fanconiho anémie je autosomálně recesivní onemocnění způsobené mutací v jednom z Fanconiho genů. Mezi projevy tohoto onemocnění patří vývojové abnormality, poruchy tvorby kostní dřeně, zvýšená citlivost na činidla způsobující tvorbu meziřetězcových spojení komplementárních vláken DNA predispozice k rakovině a mnoho dalších. Takto vzniklá spojení vláken DNA jsou opravena za pomoci opravné dráhy Fanconiho anémie, která pro správnou funkci vyžaduje monoubiquitinylaci proteinu FANCD2, která je závislá na fosforylaci proteinu FANCI pomocí ATR kinasy. Bylo zjištěno, že fosforylace FANCI spouští tuto opravnou dráhu, ovšem přesný molekulární mechanismus není doposud znám. V této práci byl studován molekulární mechanismus regulace opravné dráhy Fanconiho anémie za pomoci fosforylace proteinu FANCI. Za tímto účelem byly vytvořeny fosfomimetické mutanty tohoto proteinu, s jejichž pomocí byla sledována vazba na DNA. Hlavním cílem této diplomové práce bylo odhalit jak fosforylace proteinu FANCI ovlivňuje jeho vazbu na DNA, a to s i bez přítomnosti jeho vazebného partnera FANCD2. Fosfomimetické mutace na určitých fosforylačních místech byly zkoumány a porovnány v DNA vazebných testech a také za pomoci anizotropie fluorescence. Vliv fosforylace FANCI na monoubiquitinylaci FANCD2 byl zkoumán pomocí...

Fanconi anemia is an autosomal recessive disorder caused by mutation in one of Fanconi genes and it is manifested by developmental abnormalities, bone marrow failure, predisposition to cancer, cellular sensitivity to cross-linking agents and many other symptoms. Proteins encoded by Fanconi genes and some other proteins are part of Fanconi anemia pathway (FA pathway), which is responsible for DNA repair of an interstrand cross-link (ICL). The repair by this pathway requires monoubiquitination of FANCD2, which is induced and regulated by ATR dependent FANCI phosphorylation. The FANCI phosphorylation initiates the FA pathway but the molecular mechanism of this initialization is not known. Furthermore the proper function of entire pathway requires both: sequence of phosphorylation events of FANCI and monoubiquitination of FANCI:FANCD2 complex . The principle of this work was to study molecular mechanism of initiation and regulation of FA pathway by FANCI phosphorylation. Therefore phosphomimetic mutants of FANCI have been created to investigate their role in processes leading to FANCD2 monoubiquitination. The main aim was to reveal how the phosphorylation of FANCI affects DNA binding and also DNA binding of FANCI:FANCD2 complex. Since both DNA and FANCI phosphorylation are required for proper FANCD2...