Studium faktorů ovlivňujících transport protonů transportním proteinem MntH.

Abstract

Proteiny z rodiny Nramp (Natural resistance-associated macrophage protein) představují sekundárně aktivní membránové transportéry napomáhající buňkám v přenosu dvojmocných kovových iontů (Mn2+, Fe2+, Cd2+, Co2+, Zn2+) přes biologické membrány. Bakteriální proteiny patřící do této rodiny, MntH (Proton-dependent Manganese Transporter), byly popsány jako transportéry manganu závislé na protonovém gradientu. V této práci byl použit homolog MntH z E. coli představující vhodný modelový systém pro studium vztahu strukturny a funkce. Transport protonů tímto proteinem indukovaný kovy byl měřen postupem stanovujícím změny vnitřního pH užitím pH citlivého fluorescenčního proteinu pHluorinu. Takto určenými změnami [H+] však nelze zjistit skutečné množství transportovaných protonů, protože buňka hodnotu vnitřního pH aktivně reguluje. Pro lepší kvantifikaci transportu byla měřena pufrační kapacita bakterií pomocí detekce změn pH po přidání kyseliny propanové. Pro transport protonů indukovaný kadmiem byly změny [H+] přepočítány přes pufrační kapacitu a to pro divoký typ MntH a jeho jednobodovou mutaci N401G, o níž je známo, že ovlivňuje vnitřní pH buněk. Bylo ukázáno, že způsob zpracování podstatně ovlivňuje výsledky a promítne se také do závislosti transportu na vnějším pH. Možný vliv kadmia na respiraci byl imitován...

The natural resistance-associated macrophage proteins (Nramp) form a family of secondary active transporters facilitating the transport of divalent metal ions (Mn2+, Fe2+, Cd2+, Co2+, Zn2+) across biomembranes. Bacterial proteins belonging to the Nramp family were describedas proton-dependent manganese transporters - MntH. MntH homolog from E. coli representing a model system for structure function relationship was used in this study. Metalinduced proton transport mediated by MntH was measured by means of changes in intracellular proton concentrations using pH sensitive fluorescent protein pHluorin. This approach does not allow proper estimation of real quantity of transported protons, since the internal pH is tightly regulated. The cellular buffering capacity was calculated from measured pH changes induced by addition of propanoic acid, in order to better quantify the transport. The changes in [H+] induced by cadmium were recalculated using buffering capacity for the wild type MntH and its single-point mutation N401G, known to influence intracellular pH. It was shown that the chosen approach significantly influences results, including the dependence of transport on external pH. Potential influence of cadmium to respiration was imitated by using inhibitors of respiratory chain (KCN, NaN3) in measurements...