Characterization of native and heterologously expressed membrane transporters in yeast using fluorescent probes

Abstract

Transportéry plasmatické membrány kvasinekhrají důležitou úlohu v mnoha buněčných dějích. Mezi tyto děje patří například detoxikace a budování a udržování membránového potenciálu (ΔΨ). Metoda využívající fluorescenční sondu diS-C3(3) vyvinuta na Oddělení biofyziky Fyzikálního ústavu Univerzity Karlovy nám umožnila pohodlně studovat obojí a je zároveň vhodným nástrojem pro sledování změn těchto důležitých parametrů. Mnohé studie jak na živočišných buňkách, tak i na kvasinkách, ukázali, že etanol a jiné alkoholy inhibují funkci různých membránových kanálů, receptorů a specifických transportérů. Jako mechanismus účinku byla uvažována přímá interakce alkoholů s těmito membránovými proteiny. V naší studii jsme pro identifikaci inhibitorů pump mnohočetné lékové rezistence použili metodu s fluorescenční sondou diS-C3(3) a sadu kvasinkových kmenů s delecí genů PDR5 a SNQ2. Zjistili jsme, že pumpy kódované těmito dvěma geny jsou inhibovány n-alkoholy (od etanolu po hexanol). Ukázali jsme, že inhibiční účinek roste s délkou uhlovodíkového řetězce alkoholů, nesouvisí s poškozením plasmatické membrány a je plně revezibilní. Tyto zjištění napovídají, že studovaný inhibiční účinek nemusí nutně zahrnovat jenom změny lipidové matrice plasmatické membrány, ale může být způsoben také přímou interakcí alkoholů s pumpami....

Yeast plasma membrane transporters play crucial roles in many cellular processes, including detoxification and build-up and maintenance of the plasma membrane potential (ΔΨ). The former development of the diS-C3(3) fluorescence assay by the Biophysics Group of the Institute of Physics, Charles University, enabled us to conveniently study both, including their changes, using a simple fluorescent probe diS-C3(3). Many studies carried out on both animal and yeast cells have revealed that ethanol and other alcohols inhibit the functions of various membrane channels, receptors and solute transport proteins, and a direct interaction of alcohols with these membrane proteins has been proposed. Using the diS- C3(3) assay for multidrug-resistance pump inhibitors in a set of isogenic yeast pdr5 and snq2 deletion mutants we found that n-alcohols (from ethanol to hexanol) exhibit an inhibitory effect on both pumps, increasing with the length of the alcohol carbon chain. The inhibition is not connected with loss of plasma membrane structural or functional integrity and is fully reversible. This supports a notion that the inhibitory action does not necessarily involve only changes in the lipid matrix of the membrane but may entail a direct interaction of the alcohols with the pump proteins. Tok1p is a highly specific...