Zavedení APEXového značení pro výzkum mitochondriálních organel Giardia intestinalis a Trichomonas vaginalis.

Abstract

Giardia intestinalis a Trichomonas vaginalis jsou parazitičtí prvoci žijící v anaerobním prostředí. Z tohoto důvodu došlo k přeměně mitochondrií na organely, ve kterých neprobíhá oxidativní fosforylace. O mezimembránovém prostoru (IMS) mitochondriálních organel těchto organismů však není mnoho známo. Hlavním důvodem je obtížná izolace proteinů IMS pomocí klasických metod molekulární biologie, jako je buněčná frakcionace. Nedávno došlo k vytvoření nového značení pomocí askorbát peroxidázy (APEX). Toto značení je možní použít pro fluorescenční i elektronovou mikroskopii. APEX se také může chovat v přítomnosti biotin-fenolu jako biotin ligáza, umožňuje tak značení proteinů daného kompartmentu a také jejich izolaci. Optimalizovali jsme podmínky pro optimální aktivitu APEXu a pomocí této techniky se nám podařilo vizualizovat IMS hydrogenosomů T. vaginalis a izolovat hydrogenosomální proteiny.

Giardia intestinalis and Trichomonas vaginalis are parasitic protists living in the environment without oxygen. For this reason, their mitochondria were transformed into organelles lacking the oxidative phosphorylation. We do not know anything about the intermembrane space (IMS) of these mitochondrial organelles. Main reason is that it is hard to isolate IMS proteins using the classical methods of the molecular biology, as cell fractionation. Recently, the new ascorbate peroxidase (APEX) tag has been developed. This tagging is suitable for the fluorescence as well as the electron microscopy. APEX can also behave like biotin ligase when exposed to biotin-phenol and this allows the labeling of the proteins of the compartment as well as their isolation. We optimized the conditions for optimal APEX activity and using this technique we were able to visualize the IMS of hydrogenosomes of T. vaginalis and to isolate hydrogenosomal proteins.