Optimalizace izolace močových exozomů pro proteomické vyšetření moči v diagnostice onemocnění ledvin

Abstract

Extracelulární vezikuly (exozomy) jsou předmětem současného nefrologického proteomického výzkumu, neboť se považují za možný zdroj potenciální biomarkerů onemocnění ledvin. Tato práce se zabývá hledáním nejvhodnějšího postupu izolace exozomů z moči. Byly porovnány již popsané metody založené na odlišných fyzikálně-chemických principech izolace: hydrostatická filtrační dialýza (HFD), diferenciální ultracentrifugace, ultrafiltrace přes 100 kDa filtr, nebo srážení vzorku komerční sadou Total Exosome Isolation (from urine). Charakterizace jednotlivých izolovaných exozomálních frakcí byla provedena pomocí metod SDS-PAGE (zhodnocení přítomnosti kontaminujících proteinů), western blot analýzy (detekce exozomálních markerů TSG101, alix), analýzy trajektorie pohybu nanočástic (NTA, velikost a koncentrace vezikul), nebo transmisní elektronové mikroskopie (TEM, morfologie vezikul). Kvůli přítomnosti kontaminujících proteinů ve vzorcích moči, které by mohly zkreslovat výsledky následných proteomických analýz, byly optimalizovány podmínky štěpení nežádoucích proteinů proteinázou K před vlastními izolacemi. Bylo zjištěno, že největší výtěžnost a čistotu izolovaných exozomálních frakcí poskytuje postup kombinující HFD s diferenciální ultracentrifugací po předchozí inkubaci s optimálním množstvím proteinázy K.

Extracellular vesicles (exosomes) are the subject of current nephrology proteomics research as they are considered as a promising source of potential biomarkers of kidney disease. This work is focused on discovery of the most appropriate procedure for the urinary exosomes isolation. We have compared already described methods, based on different physicochemical principles of isolation: hydrostatic filtration dialysis (HFD), differential ultracentrifugation, ultrafiltration through a 100 kDa filter, or sample precipitation with Total Exosome Isolation (from urine) kit. Characterization of individual isolated exosomal fractions was performed using SDS-PAGE method (presence of contaminating proteins), western blot analysis (detection of exosomal markers TSG101, alix), nanoparticle tracking analysis (NTA, vesicle size and concentration) or transmission electron microscopy (TEM, vesicles morphology). Due to the presence of contaminating proteins in urine samples, which could distort the results of subsequent proteomic assays, the conditions for the cleavage of undesirable proteins by proteinase K prior to their own isolation were optimized. It has been found that the best yield and purity of the isolated exosomal fractions were provided by a process combining HFD with differential ultracentrifugation...