Study of interaction between protamine and heparin and its applicability in capillary electrophoresis

Abstract

Heparin je kyselá směs sulfatovaných polysacharidů (glykosaminglykanů) s velkou hustotou záporného náboje nacházející se přirozeně v lidském organismu. Díky své schopnosti vázat se na antithrombin III a tím urychlovat inhibici thrombinu má silné antikoagulační účinky, čehož se hojně využívá v klinické praxi při operacích, emboliích či infarktu myokardu. Protamin je naopak směs malých bazických peptidů využívaná jako antidotum při předávkování heparinem. To je možné díky elektrostatické interakci kladně nabitého protaminu se záporně nabitým heparinem. Této interakce se též využívá pro stanovení heparinu v plazmě či krvi pomocí afinitních metod. V rámci práce bylo zjištěno, že pokud jsou protamin s heparinem smíchány v jedné vialce, tvoří komplex, jehož výsledný náboj je dán vzájemným poměrem koncentrací protaminu a heparinu. Naopak v případě, že se protamin dávkuje jako vzorek a heparin je přidán do základního elektrolytu jako ligand vázající protein, je možné z úbytku plochy píku protaminu stanovit koncentraci heparinu. Kvůli složitosti interakce protaminu s heparinem byl pro zvýšení opakovatelnosti měření použit tetraarginin jako protaminu strukturně blízký model. Byla optimalizována metoda, která využívá 20 mM, resp. 60 mM kyselinu fosforečnou jako základní elektrolyt, roztok tetraargininu o...

Heparin is an acid mixture of glycosaminoglycans with high negative charge density which naturally occurs in human body. Due to its ability to bind antithrombin III and thus accelerate inhibition of thrombin it has anticoagulant effect. This is abundantly used in clinical practice for operations, in case of embolia or heart-attacks. Protamine is a mixture of small basic peptides, which is used in clinical practice as a heparin antidote. The interaction between heparin and protamine is electrostatic and is also used for determination of heparin in human plasma or blood using affinity methods. In my study it was found that if protamine and heparin are mixed in one vial, a complex is formed. Its resulting charge depends on concentration ratio of protamine and heparin. On the other hand, in case the protamine is injected as a sample and heparin is added to background electrolyte as a protein-binding ligand, it is possible to determine heparin from decreasing protamine peak area. Because of the complexity of protamine-heparin interaction, tetraarginine was used as structurally close model of protamine to increase repeatability of measurements. The method for determination of heparin was optimalised. It uses 20 mM or 60 mM ortho-phosphoric acid as background electrolyte, 1 mg/mL solution of tetraarginine...