Identification and characterization of proteins interacting with plant formins

Abstract

Fominy jsou evolučně konzervované protein, účastnící se organizace aktinového a mikrotubulárního cytoskeletu, ovlivňují tedy intracelulární transport, buněčný růst, morfogenezi a buněčnou polaritu. Všechny forminy obsahují doménu FH2, která je známá pro svou vlastnost tvořit dimery a nukleovat aktin. Cévnaté rostliny mají dvě forminové evoluční větve, třídu I a třídu II, které se liší doménovou organizací. Na základě znalostí živočišných modelů a homologie proteinových sekvencí byly navrženy dvě skupiny membránově-asociovaných proteinů jako interaktoři forminů v huseníčku (Cvrčková, 2013). První skupina kandidátů zahrnuje proteiny s FYVE doménou: FAB1A (At4g33240) a FAB1B (At3g14270), druhá skupina zahrnuje tři proteiny s doménami BAR a SH3: AtSH3P1 (At1g31440), AtSH3P2 (At4g346600) a AtSH3P3 (At4g18060). Kvasinkový dvouhybridní systém byl použit na testování proteinových interakcí vybraných proteinů z obou skupin kandidátních interakčních partnerů (FAB1A, SH3P2 a SH3P3) spolu s FH2 doménami z obou tříd rostlinných forminů. Stejný experimentální systém byl použit na testování dimerizace mezi FH2 doménami rostlinných forminů. Translační fúze FH2 domén z forminové třídy I reprezentované AtFH1 (At3g25500), AtFH5 (At5g54650), AtFH8 (At1g70140) a z třídy II reprezentované AtFH13 (At5g58160) a AtFH14 (At1g31810)...

Formins are evolutionarily conserved proteins participating in actin and microtubule organisation, affecting thus also intracellular transport, cell growth, morphogenesis and cell polarity. All formins contain FH2 domain, known to dimerize and act as a nucleator of actin. Angiosperms have two formin clades, Class I and Class II, which are distinguished by domain organisation. Based on knowledge from animal models and protein sequence homology, two groups of candidate membrane-associated formin interactors have been proposed in Arabidopsis (Cvrčková, 2013). First group of candidates consists of FYVE domain-containing proteins FAB1A (At4g33240) and FAB1B (At3g14270), the other contains proteins with BAR and SH3 domains AtSH3P1 (At1g31440), AtSH3P2 (At4g346600) and AtSH3P3 (At4g18060). Yeast two hybrid assay was used to examine protein interactions of selected proteins from both candidate groups (FAB1A, SH3P2 and SH3P3) with FH2 domains representing both plant formin clades. The same experimental setup was also used to test dimerization among FH2 domains of plant formins. Translational fusions of FH2 domains from Class I formins AtFH1 (At3g25500), AtFH5 (At5g54650) and Class II representatives AtFH13 (At5g58160) and AtFH14 (At1g31810) with the GAL4 activation domain have been co-expressed in yeast with GAL4...