Studium kinetiky trypsinového štěpení peptidů a chirálních separací biologicky aktivních látek metodou HPLC

Abstract

Dizertační práce se skládá ze dvou tematických částí; první část se zabývá charakterizací trypsinu, enzymu využívaného v proteomickém výzkumu k identifikaci proteinových sekvencí, a rychlostí trypsinového štěpení peptidů. Druhá část je zaměřena na chirální separace biologicky aktivních látek. V první části projektu byla studována kinetika štěpení syntetických peptidů trypsinema vyvinuta metoda vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) pro detekci těchto peptidů a jejich fragmentů. Za použití enzymové reakce v roztoku a metody HPLC byly stanoveny relativní rychlostní konstanty štěpné reakce problematických sekvenčních motivů. Bylo objasněno, které aminokyseliny v okolí štěpného místa zpomalují enzymovou reakci a v jaké poloze vůči štěpnému místu je jejich vliv největší. Dále bylo zjištěno, že trypsin je schopen nízké exopeptidázové aktivity, především při štěpení na konci peptidového řetězce. Dále byly zjištěny a porovnány účinnosti tří chromatografických kolon s imobilizovaným trypsinem. Imobilizace na pevný nosič se využívá pro zvýšení množství enzymu účastnícího se katalytické reakce a pro zajištění lepší opakovatelnosti a reprodukovatelnosti výsledků. Účinnost kolony syntetizované na University of North Carolina at Chapel Hill byla porovnána s účinností dvou komerčně dostupných kolon. Jako...

This dissertation thesis composes of two parts; the first part focus on the characterization of trypsin, enzyme frequently used in proteomic research for the investigation and identification of protein sequences, and its peptide digestion kinetics. The second part is aimed to the enantioseparations of biologically active compounds. First part of this project focus on tryptic digestion of synthetic peptides and the development of HPLC method for the identification of synthetic peptides and their fragments. Using the in-solution digestion and HPLC method, relative kinetic constants were determined for problematic sequences. Amino acids responsible for the decrease in trypsin catalytic activity and their location towards the cleavage site were studied. Certain slight exopeptidase activity of trypsin was noted, especially at the end of peptide chain. Furthermore, three columns with immobilized trypsin used in HPLC were compared concerning their catalytic activity. The immobilization of enzymes on solid support is used to elevate the amount of enzyme present during digestion and to assure better repeatability and reproducibility of obtained results. Activity of a new trypsin column synthesized at the University of North Carolina at Chapel Hill was compared to two commercially available trypsin columns....