Exprese a purifikace fotoaktivované proteinové nanosondy pro studium klinicky relevantních protein-proteinových interakcí
Expression and purification of protein photo-initiated nanoprobe: tool to study clinically relevant protein-protein interactions
bakalářská práce (OBHÁJENO)
Zobrazit/ otevřít
Trvalý odkaz
http://hdl.handle.net/20.500.11956/80330Identifikátory
SIS: 171284
Kolekce
- Kvalifikační práce [19109]
Autor
Vedoucí práce
Konzultant práce
Ječmen, Tomáš
Oponent práce
Koblihová, Jitka
Fakulta / součást
Přírodovědecká fakulta
Obor
Biochemie
Katedra / ústav / klinika
Katedra biochemie
Datum obhajoby
13. 6. 2016
Nakladatel
Univerzita Karlova, Přírodovědecká fakultaJazyk
Čeština
Známka
Výborně
Klíčová slova (česky)
exprese a purifikace rekombinantního proteinu, interakce protein-proteinKlíčová slova (anglicky)
expression and purification of recombinant protein, protein-protein interactionCytochrom b5 je klíčovým proteinem pro funkci a regulaci savčí oxygenasy se smíšenou funkcí (MFO), která se nachází v endoplasmatickém retikulu. Proto je také relevantním cílem v klinicky zaměřených studiích. Abychom mohli studovat interakce cytochromu b5 pomocí kovalentního fotochemického zesítění, vytvořili jsme mutanty cytochromu b5 s methioninem v několika klíčových aminokyselinových pozicích v primární sekvenci proteinu, např. v pozici serinu 23 a leucinu 41. Přirozeně se vyskytující methioniny v cytochromu b5 (pozice 96, 126 a 131) byly zároveň mutovány na leucin bez vlivu na aktivitu cytochromu b5. Náš protein byl exprimován v auxotrofních bakteriích E. coli B834(DE3) s L-2-amino-5,5-azi- hexanovou kyselinou (foto-methioninem) přítomnou v kultivačním médiu. Tento methioninový analog s fotolabilním diazirinovým kruhem je aminoacyl-tRNA synthetasami běžně inkorporován do primární sekvence proteinu. Celý expresní protokol byl optimalizován tak, abychom dosáhli maximální míry inkorporace foto-methioninu do struktury cytochromu b5. Získaný exprimovaný protein byl izolován a míra inkorporace byla stanovena hmotnostně spektrometrickou analýzou pomocí MALDI-TOF. Dosáhli jsme až 93,4% inkorporace. Po rekonstituci se svými přirozenými interakčními partnery - cytochromem P450 2B4 (králičí isoforma) a...
Cytochrome b5 is a key protein in the function and regulation of the mixed function monooxygenase (MFO) system in mammalian endoplasmic reticulum and is, therefore, a clinically relevant target for biochemical studies. To study its interactions within the MFO system using photo-initiated crosslinking, we have developed cytochrome b5 mutants with methionine in several key amino acid positions within the primary amino acid sequence, such as serine 23 and leucine 41. Also, naturally presented Met in positions 96, 126 and 131 were mutated to Leu with no effect to cytochrome b5 activity. Our protein was expressed in E. coli B834 auxotrophic type with L-2-amino-5,5-azi-hexanoic acid (photo-Met) present in the cultivation medium. This methionine analogue with photolabile diazirine ring is readily incorporated in Met positions into the primary sequence of proteins by aminoacyl-tRNA synthetases. The whole expression protocol was optimized to achieve maximal percentage of photo-Met incorporation into the expressed protein sequence. Up to 93.4% incorporation of photo-Met was achieved. The expressed protein was isolated and photo-Met incorporation was established with MALDI-TOF mass spectrometry. After reconstitution with its natural interaction partners - full-length cytochrome P450 2B4 (rabbit isoform) or...
Citace dokumentu
Metadata
Zobrazit celý záznamSouvisející záznamy
Zobrazují se záznamy příbuzné na základě názvu, autora a předmětu.
-
Applications of graph theory in protein function prediction
Výsledek obhajoby: OBHÁJENOKalábová, Nikola (Univerzita Karlova, Přírodovědecká fakulta, 2021)Datum obhajoby: 8. 6. 2021Rapidní vývoj celogenomových sekvenačních metod a jejich snižující se cena za- příčinila existenci velkého množství osekvenovaných genomů. Vývoj spolehlivých in-silico metod pro anotaci rychle rostoucího počtu osekvenovaných ... -
Funkční studie potenciální nukleotidázy kódované genem spr1057 Streptococcus pneumoniae, homologa proteinu YjjG E. coli
Výsledek obhajoby: OBHÁJENOVacková, Zuzana (Univerzita Karlova, Přírodovědecká fakulta, 2010)Datum obhajoby: 31. 5. 2010ČESKÝ ABSTRAKT Funkční studie potenciální nukleotidasy kódované genem spr1057 v Streptococcus pneumoniae, homologa proteinu YjjG Escherichia coli. Bakteriální buňky jsou neustále vystavovány nespočetným toxickým látkám, ... -
Role of the ubiquitin-like protein, Hub1, in the pre-mRNA splicing regulation
Výsledek obhajoby: OBHÁJENOHubáčková, Tereza (Univerzita Karlova, Přírodovědecká fakulta, 2018)Datum obhajoby: 4. 6. 2018Splicing is a key step of eukaryotic gene expression and as well as other steps of this vital process, splicing has to be tightly regulated. Hub1 protein is a ubiquitin-like protein which noncovalently interacts with ...