Role demetyláz z rodiny proteinů JARID 1 ve formování sestřihovém komplexu

Abstract

Sestřih pre-mRNA je proces při kterém dochází k "vystřižení" intronů z pre-mRNA a následnému spojení exonů. Řada studií indikuje, že až 80 % sestřihu pre-mRNA se uskutečňuje kotranskripčně, tedy v době, kdy nově vznikající pre-mRNA je ještě připojena k RNA polymeráze II. Sestřih pre-mRNA tedy probíhá z větší části v těsné blízkosti chromatinu. Ten může být různými způsoby modifikován a tyto modifikace mohou ovlivňovat dynamiku sestřihu pre-mRNA. Jednou z těchto modifikací je tri-metylace lysinu 4 na histonu 3 (H3K4me3). Tato histonová modifikace se nachází v oblasti kolem promotoru aktivně přepisovaných genů a její množství koreluje s transkripční aktivitou. V předchozích studiích byla navržena nepřímá vazba částice snRNP U2 (small nuclear ribonukleoprotein particle, snRNP) na H3K4me3 prostřednictvím chromodoménového proteinu CHD1. Specifickým odstraněním H3K4me3 by bylo možné zjistit vliv této histonové modifikace na tvorbu sestřihového komplexu. K tomuto účelu byla použita demetyláza z rodiny proteinů JARID1C (složený z Jmj a ARID domén), která specificky demetyluje H3K4me3. V práci byl připraven expresní plasmid, který obsahuje cDNA pro demetylázu JARID1C. Pomocí metod Western blot a imunofluorescence, bylo dokázano snížení hladiny metylace H3K4 v HeLa buňkách exprimujících JARID1C. Následně...

Pre-mRNA splicing is a process in which introns are removed from pre-mRNA and exons are ligated. Recent studies confirm that 80 % of pre-mRNA splicing takes place cotranscriptionally, while the pre-mRNA is still attached to the RNA polymerase II. Therefore, pre-mRNA splicing occurs in close proximity to the chromatin, which might influence pre-mRNA splicing. Chromatin can be modified by several modifications. One chromatin modification is histone 3 lysin 4 tri-methylation (H3K4me3). This histone modification is found in the promoter-proximal region of genes, which are actively transcribed. The levels of this modification depend on the transcription activity RNA polymerase II. Indirect binding between H3K4me3 and the U2 snRNP particle via chromo- domain protein CHD1 has been proposed. After demethylation of H3K4me3, the role of this histone modification in forming of splicing complex can be possibly explained. Demethylation of H3K4me3 is catalyzed by the demethylase, JARID1C (Jmj domain, ARID domain). cDNA for JARID1C was cloned into a plasmid. After overexpression of JARID1C in HeLa cells, reduced levels of H3K4me3 were observed by Western blot and immunofluorescence. Differences in mobility of snRNP particles in HeLa cells were measured by fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). For U2...