Substrate cleavage by mammalian Dicer isoforms

Abstract

Hostitelské organismy vyvinuly řadu antivirových odpovědí, které rozpoznávají a potlačují virovou infekci. Jedním ze znaků virové infekce je i přítomnost dvouvláknové RNA v buňce. Jedna z drah odpovídajících na dvouvláknovou RNA je RNA interference, která představuje klíčovou složku antivirové obrany u bezobratlých živočichů a rostlin. Savci využívají pro obranu před viry odlišnou dráhu, která rozpoznává dvouvláknovou RNA, nazývající se interferonová odpověd. RNA interference funguje jen v savčích oocytech a raných embryonálních stádiích, ačkoliv potřebné enzymové vybavení se nachází ve všech somatických buňkách, protože je využíváno mikroRNA dráhou. Předchozí studie ukázala, že funkčnost RNA interference v myších oocytech souvisí s přítomností oocytární isoformy Diceru (DicerO ), jež je zkrácená na N-konci. V této práci jsem se zaměřila na zhodnocení, zda DicerO zpracovává substráty typické pro RNA interferenci účinněji než nezkrácená isoforma Diceru (DicerS ), která se nachází v somatických buňkách. Za tímto účelem jsem vyvinula protokol na purifikaci Diceru, abych získala obě myší isoformy Diceru o vysoké čistotě. Následně jsem otestovala jejich aktivitu v neradioaktivní enzymové analýze na různých substrátech se strukturními prvky charakteristickými pro substráty RNA interference. Získané výsledky...

Host organisms evolved antiviral responses, which can recognize the viral infection and deal with it. One of the frequent signs of viral infection in a cell is appearance of double-stranded RNA (dsRNA). One of the pathways responding to dsRNA is RNA interference (RNAi), which functions as the key antiviral defence system in invertebrates and plants. Mammals, however, utilize for antiviral defence a different dsRNA-sensing pathway called the interferon response. RNAi functions only in mammalian oocytes and early embryonal stages although its enzymatic machinery is present in all somatic cells, where it is employed in the microRNA pathway. A previous study indicated that the functionality of RNAi in mouse oocytes functions due to an oocyte-specific isoform of protein Dicer (DicerO ), which is truncated at the N-terminus. In my thesis, I aimed to assess whether DicerO processes RNAi substrates more efficiently in vitro than the full-length Dicer (DicerS ), which is found in somatic cells. Therefore, I developed Dicer purification protocol for obtaining both recombinant mouse Dicer isoforms of high purity. I examined their activity in a non-radioactive cleavage assay using RNA substrates with structural features characteristic of RNAi substrates. My results suggest that recombinant DicerO and DicerS do not...