Usměrněná evoluce myšího polyomaviru

Abstract

Metoda usměrněné evoluce je novým přístupem pro přípravu proteinů s novými či pozměněnými vlastnostmi. Principem usměrněné evoluce je náhodná mutageneze kódující sekvence pro protein našeho zájmu následovaná selekcí vytvořených mutant na požadovanou vlastnost. Cílem této pilotní studie bylo prozkoumat možnost využití usměrněné evoluce pro změnu původního tropismu myšího polyomaviru a jeho přesměrování na buňky modelové linie nádoru prostaty. Pro přípravu náhodně mutovaného genu kódujícího hlavní kapsidový protein myšího polyomaviru, jenž je zodpovědný za interakci viru s buněčným receptorem pro vstup viru do buňky, byly využity metody "error-prone PCR" a "DNA-shuffling". Produkce virů nesoucích mutovaný hlavní kapsidový protein byla zajištěna místně-specifickou rekombinací Cre/loxP. Práce se zabývala i návrhem a charakterizací systému selekce virových mutant. Bylo zjištěno, že prostatické nádorové linie se významně liší ve schopnosti vázat a internalizovat částice odvozené od myšího polyomaviru. Tohoto poznatku může být v budoucnu využito pro přípravu viru podobných částic určených pro diagnostiku nádoru prostaty. Práce prokázala, že metodu usměrněné evoluce lze použít pro přípravu mutantních polyomavirů a identifikovala několik problematických částí postupu.

The method of directed evolution represents a new approach to generate proteins with new or altered properties. The principle of directed evolution is random mutagenesis of the coding sequence for a protein of our interest followed by selection of generated mutants for the desired property. The aim of this pilot study was to investigate the possibility of utilization of directed evolution for alteration of mouse polyomavirus original tropism and virus retargeting to a model prostate cancer cell line. To generate randomly mutated gene encoding the major capsid protein of mouse polyomavirus, which is responsible for the interaction of the virus with cellular receptor for viral cell entry, error-prone PCR and DNA shuffling methods were used. Production of viruses composed of mutant major capsid protein was ensured by Cre/loxP site-specific recombination. The thesis also dealt with the design and characterization of the system for viral mutant selection. It was found that the prostate cancer cell lines markedly vary in their ability to bind and internalize particles derived from mouse polyomavirus. This knowledge can be used for the preparation of virus-like particles for prostate cancer diagnostics in the future. The study demonstrated that the method of directed evolution can be used for production...