Vazba paralogů EXO70 na ATG8 a funkční rozdělení rodiny EXO70 dle účasti v autofagii (Arabidopsis thaliana).

Abstract

Exocyst je komplex složený z osmi podjednotek, který zprostředkovává poutání váčků před jejich splynutím s cílovou membránou. V poslední době přibývájí zjištění, že kromě této funkce hraje exocyst roli i v buněčném procesu zvaném autofagie. U rostlin je počet paralogů některých podjednotek exocystu neobvykle velký. V genomu Arabidopsis thaliana je paralogů podjednotky Exo70 až 23. Předpokládá se, že tyto paralogy získaly během evoluce nové funkce - včetně účasti v autofagii. Použitím dvouhybridního experimentu v kvasince je zde ukázáno, že jedině paralogy Exo70B1 a Exo70B2 interagují s autofagosomálním markerem Atg8. Proximita těchto paralogů a Atg8 in vivo byla potvrzena nezávislou metodou FRET. Je pozoruhodné, že Exo70B2 interaguje s Atg8f silněji než Exo70B1. Exprese Exo70B1-mRUBY pod přirozeným promotorem ukazuje strukturu drobných statických teček. Po opůsobení tunicamycinem, který vyvolává autofagii, je indukován pohyb těchto struktur. Homologní modely terciární struktury paralgů Exo70B1 a Exo70B2 v kombinaci s bioinformatickými predikcemi založenými na výsledcích naznačují místa interakce s Atg8. Nabízí také možné vysvětlení paralogu Exo70B2 jako silnějšího interaktora.

The exocyst, an octameric protein complex conserved among all eukaryotes, mediates tethering of the vesicle prior to its fusion with the target membrane. Apart from the function of exocyst in exocytosis, new studies from both mammalian and plant fields report its involvement in the cellular self-eating process called autophagy. In land plants the number of paralogs of some exocyst subunits is extraordinarily large. There are 23 paralogs of Exo70 subunit in Arabidopsis thaliana. It is supposed that these paralogs have acquired functional specialization during the evolution - including involvement in autophagy. Using yeast two- hybrid assay it is shown here that Exo70B1 and Exo70B2, but not other Arabidopsis Exo70 paralogs interact with Atg8, an autophagosomal marker. The proximity of these two paralogs and Atg8 in vivo was confirmed by independent Förster resonance energy transfer (FRET) method. Interestingly, interaction of Atg8f with Exo70B2 paralog appears to be stronger than with Exo70B1. Exo70B1-mRUBY expressed under the natural promoter shows punctate membrane structures that are mostly static. That changes after the tunicamycin treatment - movement of some of these dots was induced. Homology modeling of Exo70B1 and Exo70B2 proteins tertiary structure in combination with bioinformatic prediction based...