Rekombinantní expresse chloridového kanálu z E. coli a jeho strukturní charakterizace

Abstract

Proteinová rodina chloridových kanálů zastává významnou funkci pro fyziologické pochody v organismu. Mechanismus jejich působení však ještě nebyl zcela vyřešen. Poškození, či mutace těchto proteinů vyvolávají závažná onemocnění, k jejichž léčbě by mohlo pomoci právě popsání transportních mechanismů těchto kanálů. Jelikož se savčí chloridové kanály obtížně produkují, jsou experimenty prováděny na prokaryotických variantách, jejichž struktura je známa a produkují se s vysokým výtěžkem. Většina experimentů je dnes prováděna staticky pomocí krystalografie. V této práci jsme se zaměřili na studium strukturních změn chloridového kanálu z E. coli pomocí vodík/deuteriové výměny. Tato metoda umožňuje dynamicky sledovat změny konformace proteinu v závislosti na pH a navázaných iontech. Experimenty byly prováděny za protonovaného (pH 4,5) a deprotonovaného stavu (pH 7,5) a za přítomnosti rozličných aniontů: Cl− , SCN− , I− , F− , TAR.(tartarový aniont). Data, která jsme získali, potvrzují některé teorie ohledně funkce chloridového kanálu jako Cl− /H+ antiporteru a přinášejí i nové poznatky. Předmětová slova biochemie, struktura proteinů, vodík/deuteriová výměna, hmotnostní spektrometrie Klíčová slova chloridový kanál, hmotnostní spektrometrie, vodík/deuteriová výměna, rekombinantní exprese, purifikace proteinů,

Chloride channel family has been shown to play a significant role in physiological homeostasis processes. The function mechanism of these proteins has not yet been clearly understood. Their deficiency or mutation causes serious human illnesses. Our understanding of the chloride channels' transporting mechanisms can lead to better treatment of these illnesses. As mammalian chloride channels are difficult to prepare in laboratory, the experiments are usually done on homologous chloride channels from prokaryotic organisms. The structures of prokaryotic chloride channels have been solved and moreover they are produced with high yields. Most experiments currently use protein crystallography and provide a static picture of the system. This thesis is focused on the study of structural changes of an E. coli chloride channel using hydrogen/deuterium exchange. This method enables us to monitor dynamic conformation changes dependent on pH and exchanged ions. The measurements were done for the protonated (pH 4.5) and deprotonated state (pH 7.5) and/or in the presence of various anions: Cl− , SCN− , I− , F− , TAR. (tartaric anion). The obtained results justified the theories explaining the function of chloride channel as Cl− /H+ antiporter and provided new findings. Subject words biochemistry, protein...