Vývoj HPLC-DAD-MS/MS metody pro stanovení vybraných toxinů v Muchomůrce zelené.

Abstract

(CZ) Tato práce byla zaměřena na vývoj a optimalizaci analytické metodiky, pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie s detekcí diodovým polem (HPLC-DAD) a vysokoúčinné kapalinové chromatografie s detekcí diodovým polem a tandemovou hmotnostní spektrometrií (HPLC-DAD-MS/MS), pro stanovení amatoxinů (α- a β-amanitinu) a falotoxinů (falacidinu a faloidinu) v hrubém extraktu z kloubouku muchomůrky zelené. S cílem zaručit spolehlivost analytických výsledků byl studován vliv různých parametrů na kvalitu separace a samotné stanovení. Vyvinutá metoda HPLC-DAD dosahuje dobré linearity v rozmezí koncentrací 1 - 100 µg/ml, kdy korelační koeficienty pro obě kalibrační závislosti všech sledovaný látek jsou vyšší než 0,997. Pro stanovované toxiny byly vypočteny limity detekce (LOD) a kvantifikace (LOQ), pro α-amanitin 0,90 µg/ml (LOD); 2,99µg/ml (LOQ), β-amanitin 1,07 µg/ml (LOD); 3,56 µg/ml (LOQ), falacidin 2,17 µg/ml (LOD); 7,26 µg/ml (LOQ) a faloidin 0,79 µg/ml (LOD); 2,64 µg/ml (LOQ). Klíčová slova: muchomůrka zelená, -amanitin,-amanitin, falacidin, faloidin, extrakce tuhá látka-kapalina, HPLC-DAD, HPLC-DAD-MS/MS

(EN) This work has been focused on the development and optimization of analytical methodology, using high performance liquid chromatography with diode array detection (HPLC-DAD) and high performance liquid chromatography with diode array and tandem mass spectrometric detection (HPLC-DAD-MS/MS) for the determination of amatoxins (α- and β-amanitin) and phalotoxins (phallacidin and phalloidin) in the crude extract from cap of Amanita phalloides with the option to later use for clinical purposes. In order to guarantee the reliability of the analytical results the influence of various parameters on the quality of the separation and the determination of toxins was studied. The developed HPLC-DAD method achieves good linearity in the concentrations range 1 - 100 µg/ml, with correlation coefficients higher than 0,997. Limits of detection (LOD) and quantitation (LOQ) were calculated for all the studied toxins with following values: for α-amanitin 0,90 µg/ml (LOD); 2,99 µg/ml (LOQ), β-amanitin 1,07 µg/ml (LOD); 3,56 µg/ml (LOQ), phallacidin 2,17 µg/ml (LOD); 7,26 µg/ml (LOQ) and phalloidin 0,79 µg/ml (LOD); 2,64 µg/ml (LOQ). Key words: Amanita phalloides,-amanitin,-amanitin, phallacidin, phalloidin, solid-liquid extraction, HPLC-DAD, HPLC-DAD-MS/MS .