Úloha membránového cholesterolu v signalizaci delta-opioidního receptoru Korelace se strukturou plazmatické membrány

Abstract

Study of HEK293 cells stably expressing fusion protein between delta opioid receptor (δ-OR) and pertussis toxin-insensitive mutant of Gi1α protein, δ-OR-Gi1α (Cys351 -Ile351 ), provided the following results. Decrease of plasma membrane cholesterol content (cholesterol depletion) induced by cyclic oligosaccharide β-cyclodextrin did not affect binding of specific δ-OR agonist, [3 H]DADLE. Neither the maximum number of binding sites nor the affinity of [3 H]DADLE binding was changed by cholesterol depletion. However, the ability of δ-OR to activate cognate trimeric G proteins was impaired. EC50 value of agonist-stimulated [35 S]GTPγS binding was an order of magnitude higher. This effect was observed in case of both control and pertussis toxin-treated cells. It means that cholesterol depletion markedly reduced the efficiency of functional coupling of δ-OR to endogenously expressed pertussis toxin-sensitive G proteins of Gi/Go family as well as covalently bound Gi1α (Cys351 -Ile351 ) protein. Unchanged plasma membrane cholesterol content is therefore important requirement for proper δ-OR function. Detection of the effect of cholesterol depletion on the functional activity of δ-OR was supported by the analysis of changes in biophysical state of plasma membrane using fluorescent membrane probes,...

Studium buněk linie HEK293 stabilně exprimujících fúzní protein mezi opioidním receptorem typu delta (δ-OR) a mutantou Gi1α proteinu necitlivou vůči působení pertussis toxinu, δ-OR-Gi1α (Cys351 -Ile351 ), poskytlo následující výsledky. Snížení obsahu (deplece) cholesterolu v plazmatické membráně s pomocí cyklického oligosacharidu β-cyklodextrinu nezměnila vazbu specifického agonisty δ-OR, [3 H]DADLE. Ovlivněn nebyl ani celkový počet vazebných míst, ani afinita vazby [3 H]DADLE na receptor. Deplece cholesterolu však narušila schopnost δ-OR aktivovat trimerní G proteiny. Hodnota EC50 agonistou stimulované vazby [35 S]GTPγS se zvýšila o jeden řád. Tento účinek byl pozorován jak v případě kontrolních buněk, tak v případě buněk vystavených účinku pertussis toxinu. To znamená, že deplece cholesterolu významně snížila účinnost funkčního spřažení nejen mezi δ-OR a endogenními G proteiny třídy Gi/Go, které jsou citlivé k působení pertussis toxinu, ale rovněž mezi δ-OR a kovalentně připojeným Gi1α (Cys351 -Ile351 ) proteinem. Nezměněný obsah cholesterolu v plazmatické membráně je tedy důležitou podmínkou správné funkce δ-OR. Stanovení vlivu deplece cholesterolu na funkční aktivitu δ-OR bylo podpořeno analýzou změn biofyzikálních vlastností plazmatické membrány s pomocí fluorescenčních membránových sond,...