Výskyt β-rutinosidasy v eurokaryotických mikroorganismech

Abstract

Rutinosidy jsou velmi běžné glykosidické prekurzory aromatických látek. Navázané glykosidy ovlivňují aroma vín, chuť džusů atd, hydrolýzou glykosidické vazby je možno zvýšit aroma některých produktů. Jedním z enzymů schopných této hydrolýzy je i β-rutinosidasa produkovaná extracelulárně kmenem Aspergillus niger. Purifikovaná β rutinosidasa byla částečně sekvenována (MALDI-TOF/TOF), výsledek analýzy byl porovnán se sekvencemi v databázích (BLAST). Inzert kódující β-rutinosidasu byl ligován do expresního vektoru pPICZα A. Jako expresní systém byl použit kmen Pichia pastoris KM71H. Bylo zjištěno, že gen pro β rutinosidasu obsahuje 1137 bp kódující protein o 379 aminokyselinách. Elektroforézou v polyakrylamidovém gelu s dodecylsíranem sodným byla zjištěna molekulová hmotnost enzymu 60 kDa, deglykosylovaná froma 45 kDa. pH optimum enzymu bylo stanoveno jako 3,0 a teplotní optimum při teplotě 50 řC. Substrátem pro stanovení enzymové aktivity byl p nitrofenyl β rutinosid. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

Rutinosides are very common glycosidic aroma precursors. The glycosidic moiety influences wine aroma, flavour and taste of juices, so its cleavage has many consequences. These interesting insights led us to a diglycosidase - the extracellular β-rutinosidase from Aspergillus niger. The purified β- rutinosidase was partly analyzed by MALDI-TOF/TOF. The insert encoding for β-rutinosidase was ligated into the expression vector pPICZα A. Pichia pastoris KM71H was used as an expression system. It was find out, that β rutinosidase gene consists of a 1137 bp, encoding protein with 379 amino acids. The enzyme was determined to have relative molecule mass 60 kDa by sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis. The pH and temperature optima of the enzyme were found to be 3,0 and 50 řC, respectively. p-Nitrophenyl-β-rutinoside was used as a substrate Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)