Význam replikačně defektních prasečích endogenních retrovirů při xenotransplantaci

Abstract

Nedostatek lidských tkání a orgánů pro transplantace může být vyřešen xenotransplantací. Jako zdroj orgánů je mimořádně vhodné miniaturní prase. Přítomnost pathogenů, které mohou infikovat příjemce, zvláště prasečích endogenních retrovirů (PERV), představuje ovšem riziko úspěšné xenotransplantace. Infekční PERV se rozpadá na tři skupiny podle svých obalových glykoproteinů. PERV-A a PERV-B jsou polytropní viry, které infikují lidské, prasečí a norčí buňky in vitro. PERV-C je evolučně mladší ekotropní izolát. V minulosti jsme popsali nový, replikačně defektní provirus PERV-A MAMBA, který se vysoce exprimoval v tkáních velkého bílého prasete z českého chovu. V rámci projektu jsem se zabýval epigenetickou regulací transkripce PERV-A MAMBA v prasečích tkáních a orgánech. Abych podpořil získané výsledky, provedl jsem in vitro DNA methylační esej se dvěma PERV LTR. Methylované a nemethylované reportérové plazmidy, obsahující 5' LTR provirovou oblast, byly transfekovány do buněk a zároveň byla stanovena aktivita luciferázy sdružené s LTR. V obou případech methylace LTR snížila významně expresi reportérového genu. Transkripce z PERV proviru je tedy citlivá k methylaci. Také jsem použil PERV-A MAMBA ke studiu rekombinace PERV. Připravil jsem 293T a BeWo buňky, které produkovaly virovou RNA. Tyto buňky jsem...

The shortage of human tissues and organs for allotransplantation can be overcome by xenotransplantation. As a source of organs, the miniature pig is convenient. However, the presence of pathogens transmissible to the recipients, especially porcine endogenous retrovirus (PERV), represents a threat for successfull xenotransplantation. Infectious PERVs contain three classes of envelope glycoprotein. Two classes, PERV-A and PERV-B are polytropic, they can infect human, pig and mink cells in vitro. PERV-C is evolutionary young, ecotropic isolate that can infect pig only. We previously detected a new full-lenght, but replication-defective PERV-A isolate dubbed (MAMBA) with high transcriptional activity in Large-White pig from a Czech breed. To support our results with PERV-MAMBA epigenetic regulation in pig tissues, in vitro DNA methylation essay was accomplished. Methylated or non-methylated reporter plasmids containing provirus 5' LTR were transfected into 293T cells and luciferase activity was measured. In both cases, methylated LTR decreased significantly expression of luciferase. Thus, PERV LTR-driven transcription is sensitive to DNA methylation. We also used PERV-A MAMBA provirus to study recombination between two pig endogenous retroviruses. We prepared 293T and BeWo cell clones harboring PERV-A...