Characterization of protein structures using chemical cross-linking and mass spectrometry.

Abstract

Some proteins require presence of their specific ligand, cofactor or prosthetic group for their activity. Binding of this specific molecule can cause conformational changes which permit to perform their function. In some occasions the identification of conformational changes could be really challenging task. In this thesis we describe the novel approach for monitoring structural changes in proteins using chemical cross-linking and high resolution mass spectrometry and its application on model calmodulin system. It is demonstrated that analysis using isotope-labelled cross-linking agents enabled us to get insight into the structural rearrangement caused by presence or absence of the protein ligand. However, it is shown that the method has potential drawback due to limited enzymatic proteolysis. The novel approach that also makes it possible to quantify the changes in protein structure was used together with other methods for characterization of the neutral trehalase Nth1 in complex with Bmh1 protein (yeast isoform of protein 14-3-3). The results revealed that Bmh1 induce structural rearrangement of Nth1 molecule with changes within the EF- hand like motif which is essential for the activation process.

Některé bílkoviny k plnění své funkce vyžadují přítomnost specifického ligandu, kofaktoru nebo prostetické skupiny. Vazba této specifické molekuly může v molekulách bílkovin způsobit konformační změny. V některých případech může charakterizace takovýchto konformačních změn představovat velmi náročný úkol. V předkládané práci je popsán nový přístup sloužící ke sledování těchto změn pomocí kombinace chemického zesítění a hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením. Na modelovém systému, kterým byl zvolen protein kalmodulin, je ukázáno, že analýza pomocí izotopově značených síťovacích činidel umožnuje získat přehled o změnách struktury způsobených přítomností nebo nepřítomností ligandu. Byly rovněž popsány potenciální nedostatky metody, které tkví především v nedostatečné proteolýze proteinu. Tato nová metoda, která zároveň umožňuje kvantifikaci strukturních změn proteinů, byla použita spolu s dalšími technikami k charakterizaci neutrální trehalasy Nth1 v komplexu s proteinem Bmh1 (kvasinková forma proteinu 14-3-3). Výsledky odhalily, že vazba proteinu Bmh1 vyvolává přeskupení molekuly Nth1 se změnami především v tzv. "EF-hand" podobném motivu, který je nezbytný pro aktivační proces.