Studium stability katalytické domény neutrální trehalasy pomocí diferenční skenovací fluorimetrie

Abstract

Předkládaná bakalářská práce je součástí projektu, jehož záměrem je krystalizace trehalasové domény neutrální trehalasy Nth1 ze Saccharomyces cerevisiae. Hlavním cílem této bakalářské práce je optimalizace purifikačního protokolu dvou různých konstruktů kvasničné Nth1 a určení optimálního pufru pro krystalografii těchto konstruktů pomocí metody diferenční skenovací fluorimetrie DSF. Trehalasy jsou důležité, vysoce konzervované enzymy, které se nacházejí v řadě organismů. Tyto enzymy patří do třídy hydrolas, podskupiny glykosidas a jejich společnou vlastností je to, že hydrolyticky štěpí molekulu trehalosy na dvě jednotky glukosy. Trehalosa je přirozeně se vyskytující neredukující disacharid, který slouží v buňkách kvasinek jako zásobárna uhlíku a energie a dále jako universální ochrana proti stresovým podmínkám. Trehalosa a její hydrolýza je důležitá v životním cyklu hmyzu, neboť je přítomná jako hlavní cukerná složka hemolymfy hmyzu, takže některé trehalasové inhibitory by mohly být využity jako insekticidy. Do této doby však byla vyřešena pouze jediná struktura trehalasy z prokaryotního organismu Escherichia coli. Z tohoto důvodu je velmi důležité vyřešit strukturu trehalasy z eukaryotního organismu. Klíčová slova Nth1, exprese, purifikace, DSF Klíčové předměty Proteinová biochemie, biofyzikální...

This bachelor thesis is part of a project aiming for the crystallization of trehalase domain of neutral trehalase Nth1 from Saccharomyces cerevisiae. The main goal of this thesis is to optimize the purification protocol of two different constructs of yeast Nth1 and determine the optimal buffer for crystallography of these constructs using the differential scanning fluorimetry DSF. Trehalases are important, highly conserved enzymes found in many organisms. These enzymes belong to the class of hydrolases, subgroup of glycosidases and their common feature is hydrolytic cleavage of trehalose molecule into two glucose subunits. Trehalose is a naturally occurring non-reducing disaccharide which serve in yeast cells as storage carbohydrate and energy and stress metabolite. Trehalose and its hydrolysis is very important in the life cycle of the insect, as it is present as the main sugar component of insect hemolymph, so some trehalase inhibitors could be used as insecticides. By this time, however, only one structure of trehalase from a prokaryotic organism Escherichia coli was solved. For this reason it is very important to solve the structure of trehalase from a eukaryotic organism. Keywords: Nth1, expresion, purification, DSF Key subjects: Protein biochemistry, biophysical chemistry