Struktura a funkce rekombinantního P2X4 receptoru

Abstract

4 Abstract Purinergic P2X receptors are membrane ion channels activated by extracellular ATP. There are seven isoforms of mammalian P2X receptors designated as P2X1-7, which according to their structure represent a specific family of ligand gated ionic channels, with extraordinary structural/functional properties. The P2X receptor consists of three subunits and each subunit has two transmembrane domains. Crystalographic data demonstrate that ionic channel pore is situated between the second transmembrane domains. Crystal structure of P2X4 receptor from the zebrafish (Danio rerio) is available in both open and closed state of the channel and the exact structure of ATP binding site is solved. The aim of this thesis was to study the structure-function relationships in a model of recombinant P2X4 receptor of the rat. By employing the point mutagenesis and electrophysiological recording, the functional importance of conserved cysteine residues in the ectodomain and amino acid residues which form the extracellular vestibule was investigated. All ten cysteins were substituted one by one with alanine or threonine and ATP-induced currents were measured from HEK293T cells expressing wild type (WT) and mutated P2X4 receptors. The results indicate that C116A, C126A, C149A and C165A mutations disrupt two disulfide bonds...

5 Abstrakt Purinergní P2X receptory jsou membránové iontové kanály aktivované extracelulárním ATP. U savců bylo dosud nalezeno sedm různých podtypů, označovaných jako P2X1-7, které svojí stavbou představují rodinu ligandem řízených iontových kanálů s výjimečnými strukturně/funkčními vlastnostmi. Každý P2X receptor je tvořen třemi podjednotkami, kde každá podjednotka má dvě transmembránové domény. Krystalografická data ukazují, že pór iontového kanálu se nachází mezi druhými transmembránovými doménami. Krystalová struktura P2X4 receptoru zebřičky (Danio rerio) je dostupná pro receptor v uzavřeném a otevřeném stavu s navázanou molekulou ATP, a proto je přesná struktura vazebného místa pro ATP vyřešena. Cílem této dizertační práce bylo studium strukturně-funkčních vlastností v modelu rekombinantního P2X4 receptoru. Technikou bodové mutageneze a elektrofyziologickou technikou patch clamp byl zkoumán funkční význam pěti konzervovaných cysteinových párů v ektodoméně a funkční úloha aminokyselinových zbytků, které tvoří extracelulární vestibul P2X4 iontového kanálu potkana. Všech deset cysteinů, jeden po druhém, bylo nahrazeno alaniny nebo threoniny a ATP-stimulované proudy byly snímány z HEK293T buněk nesoucích divoký typ P2X4 receptoru nebo jeho mutace. Výsledky získané u mutací C116A, C126A, C149A a C165A...