Use of Chiral Separations for the Determination of Enzyme Enantioselectivity

Abstract

Závěr Enantioselektivni enzymy hrají významnou roly vmetabolických drahách chirá|ních látek. Enantioselektivní metabolismus produktu lipidové peroxidace HNE byl studoviín s vpžitímměření enrymové kinetiky' By|o zjištěno, žeALDH přítomné v mitochondriích z krysího mozku se lišíve schopnosti detoxifikovat jednotlivé enantiomery HNE. Z naměřených kinetických parametrů purifikovaných rekombinantních enzymů vyplyvá' žekrysí ALDHSA enantioselektivně oxiduje (R)-HNE, zatímco krysí ALDH2 nevykazuje žádnou enantioselektivitu. Dá|e, přímá a nepřímá reversní HPLC metoda pro stanovení HNEA enantiomerů byla vyvinuta a validována. Nepřímá metod a je za|oženana derivatizaci HNEA s chiráním amino činidlemANPAD, která je následovaná separací vzniklých diastereoisomeru na koloně Spherisorb oDS2. Přímá separace HNEA enantiomeru byla provedena s pouŽitím CSP na brízípolysacharidů na koloně Chiralpak AD.RH. Enantioselektivní enzymy jsou užitečnébiokatalyzátory, umožňujícílevnou přípraw opticky čistýchchemikálií. S použitímchirálního GC na cyklodextrinových CSP byl proveden screening epoxid hydroláz produkovaných rozličnýmimikroorganismy. Nové enantioselktivní enzymy by|y nalezeny. Tato disertačnípráce popisuje vyuoj a optimalizaci analytických metod pro stanovení ruzných sloučenin ýznamných v souvislosti s enzymovou...

Conclusion Enantioselective enzymes pray important rore in metaboric pathways of chirar compounds. Enantioselective metabolism of lipid peroxidation product HNE was studied using measurement of enzyme kinetics. Difference in ability to detoxiý individua| HNE enantiomers by rat brain mitochondriar ALDHs was found. Based on kinetic parameters of purified recombinant enz),Ťnes' it was concluded, that rat ALDH5A enantioselective|y oxidized (R)-HNE' whereas rat ALDH2 was not enantioserective. Moreover, direct and indirect RP-HPLC methods for the separation of HNEA enantiomers were deveroped and validated. The indirect method involved pre-corumn derivatization with a chiral amino agent ANPAD' and subsequent separation ofdiastereomers on a Spherisorb oDS2 column. The direct separation of HNEA enantiomers was performed using the porysacharide-based CSP, Chiralpak AD-RH. Enantioserective enzymes are useful biocatalyzators a'owing cheap preparation of optically pure chemicals. screening of epoxide hydrolases produced by various microorganisms was performed and enantioselective enzymes were found using chiral GC on cyclodextrin-based CSps. In summary, this thesis describes development and optimization of the analytical methods for determination of various chiral compounds implicated in enzyme enantioselectiviý. All...