Purifikace a charakterizace vybraných enzymů z Rhizobium radiobacter R89 katalyzujících oxidačně-redukční reakce na uhlíku C-hydroxylovaných morfinových skeletů.

Abstract

Bakterie z rodiny Rhizobiaceae jsou známé přítomností mnoha enzymů účastnících se metabolismu dusíku. A to nejen z pohledu fixace dusíku (tzv.diazatrofie) a schopnosti tvořit s rostlinami mutualistické vztahy, ale i z pohledu rostlinné patogeneze (genus Agrobacterium). Rhizobium radiobacter R89 (uložen v České sbírce mikroorganismů v Brně jako R89-1) je bakteriální kmen schopný biotransformace kodeinu a morfinu na celé spektrum farmakologicky významných derivátů. Cílem této práce je purifikace a charakterizace dvou vybraných enzymů katalyzujících oxidačně-redukční reakce, které jsou klíčové pro začátek biodegradační dráhy morfinových skeletů. Nejprve byl charakterizován biotransformační potenciál daného kmene a pro purifikaci enzymů zodpovědných za zvolené reakce byly použity biochemické, molekulárně biologické a bioinformační metody. Vzhledem k neúspěšné purifikaci enzymů z původního materiálu byly strukturní geny kódující proteiny klonovány a heterologně exprimovány v bakteriálním expresním systému a následně charakterizovány. Nalezená proteinová sekvence a enzymová charakterizace (základní kinetické parametry, substrátová specifita a teplotní stabilita) odhalily odlišný původ enzymů a tak i objasnily neúspěch původního purifikačního postupu z mikroorganismu Rhizobium radiobacter R89.

The Rhizobiaceae bacteria are known for its varied nitrogen metabolism: especially its nitrogen fixation, so called diazotrofia, its capability of symbiosis with plants, or on the contrary plant pathogenesis (genus Agrobacterium). Rhizobium radiobacter R89 (stored in Czech Collection of Microorganism, in Brno as R89-1) is bacteria strain capable of codeine and morphine biotransformation to whole spectrum of pharmacologically significant derivates. This work is focused on purification and characterization of two selected enzymes that catalyze oxidation-reduction reactions, the crucial beginning of morphine skelets biodegradation. At the first, the biotransformational potential of the strain was evaluated and biochemical, molecular biological and bioinformatical approaches were employed to purify the responsible enzymes. Considering unsuccessful purification from Rhizobium radiobacter R89-1, the proteins structural genes were cloned and heterologously expressed in bacterial system and afterward characterized. Found protein sequence and enzyme characterization (basic kinetic measurements, substrate specificity and thermo- stability) have revealed different origin of the enzymes and clarify reasons why the original purification procedure was not successful.