Příprava prasečích indukovaných pluripotentních kmenových buněk - model Huntingtonovy choroby.

Abstract

Dosud se nepodařilo vytvořit stabilní linie prasečích ESCs. Linie prasečích ES like buněk nejsou schopné dlouhodobé sebeobnovy nebo mají omezenou schopnost diferenciace. Alternativou k pESCs jsou piPSCs, které lze vytvořit přeprogramováním somatických buněk několika transkripčními faktory nesenými virovými vektory. Linie piPSCs se podařilo vytvořit několika skupinám. Většina linií piPSCs je ale závislá na transgenní expresi z důvodu nedokončeného procesu přeprogramování a nedostatečné aktivace vlastních genů pluripotence. Zvýšená exprese vnesených transgenů má negativní vliv na schopnost diferenciace piPSCs. Proto byly pro vytvoření piPSCs v této práci použity nevirové Piggybac transpozony, které lze z genomu zpětně vystřihnout. Zároveň byly pro přeprogramování použity malé molekuly (nízkomolekulární inhibitory), které jsou schopné zvýšit účinnost přeprogramování a aktivaci endogenních genů pluripotence. Tento systém pro vytvoření piPSCs má potenciál k vytvoření piPSCs v naivním stavu pluripotence. Po vystřižení transgenů je možné získat piPSCs bez inserčních mutací a s neomezenou schopností diferenciace. Prase (Sus Scrofa) je zároveň důležitým zvířecím modelem pro preklinické stadium výzkumu nemocí. Pro vytvoření piPSCs byly použity primární buňky z prasat s mutovaným huntingtinem. Integrace sekvence...

Stable porcine ES cell lines have not been succesfully established yet. Ability to selfrenew or to differentiate has been limited in different porcine ES-like cell lines so far. PiPSCs represent an alternative to pESCs. PiPSCs can be generated by reprogramming of somatic cells by introduction of several transcription factors on viral vectors and were established by several groups. However, the majority of piPS cell lines depend on transgene expression because of incomplete reprogramming and weak activation of endogenous pluripotency genes. Transgene expression can infuence differentiation potential of piPSCs. Therefore, we have used integrative and reexcisable PiggyBac transposons to generate viral free piPSCs. At the same time, small molecules (low-molecular inhibitors) with potential to increase reprogramming efficiency and to activate endogenous pluripotency genes were used in the reprogramming media. This strategy has a potential for generation of naive piPSCs. Successful excision of transgenes would generate transgene-free piPSCs with uncompromised differentiation potential. Pig (Sus Scrofa) is at the same time an important animal model in preclinical stage research of the diseases. Somatic cells used for generation of piPSCs were isolated from pigs carrying mutated huntingtin. Integration of the...