Peptidázy monogeneí čeledi Diplozoidae

Abstract

Proces trávení krve u monogeneí podtřídy Polyopistocotylea je znám pouze z ultrastrukturálních a histochemických analýz. V porovnání s ostatními krevsajícími parazity existuje jen malé množství biochemických a molekulárně biologických studií zabývajících se trávicími enzymy u monogeneí vůbec. Proto jsme se zaměřili na biochemickou a molekulární charakteristiku hydrolytických enzymů (peptidáz) u hematofágních druhů Paradiplozoon bliccae a Eudiplozoon nipponicum. Podařilo se nám prokázat přítomnost cysteinových peptidáz, zejména cathepsinu L, v exkrečně sekrečních produktech a solubilním proteinovém extraktu u P bliccae a E. nipponicum. Detekce proběhla použitím fluorogenních substrátů, specifických inhibitorů a značenou sondou DCG-04. Na gelech / membránách po elektroforéze / blotování byly zaznamenány proužky o velikost 35 kDa u obou zástupců a navíc 24 kDa u E. nipponicum. Vzorky byly rozděleny rovněž pomocí 2D elektroforézy a na gelech byly zaznamenány relevantní spoty o velikosti 35 kDa u P. bliccae a 25 ˗ 35 kDa u E. nipponicum, které byly potvrzeny hmotnostně spektrometrickou analýzou jako cathepsiny L. Pomocí degenerovaných primerů, navržených na základě konzervovaného místa cysteinových peptidáz, byla získána částečná sekvence genu pro cathepsin L E. nipponicum. Metodou 3' RACE PCR byla...

The blood processing mechanisms in monogeneans of the subclass Polyopisthocotylea are known from ultrastructural and histochemical analyses only. In contrast to other blood- feeding parasites, just few biochemical and molecular analyses have been done on digestive enzymes in monogeneans. Therefore, we focused on the biochemical and molecular characterization of hydrolytic enzymes (peptidases) in the hematophagous species Paradiplozoon bliccae and Eudiplozoon nipponicum. The presence of the cysteine class peptidases, mainly cathepsin L, in excretory- secretory products and soluble protein extracts of P. bliccae and E. nipponicum we found. Detection was carried out using fluorogenic substrates, specific inhibitors and the labelled probe DCG-04. On the gels / membranes after electrophoresis / blotting we detected bands of approximately size of 35 kDa in the case of both species and 24 kDa for E. nipponicum. Soluble protein extracts of worms were separated by 2D gel electrophoresis and relevant spots around 35 kDa (P. bliccae) and around 25 ˗ 35 kDa (E. nipponicum) were confirmed by mass spectrometry as cathepsins L. Using degenerate primers based on the conserved motifs of cysteine class peptidases, a partial sequence of cathepsin L gene from E. nipponicum was obtained. Furthermore, 3'RACE PCR method...