Charakterizace transkripčního aparátu lineárních plasmidů kvasinky Kluyveromyces lactis

Abstract

Transkripce je zásadním krokem exprese genetické informace. Tento proces závisí na proteinovém komplexu vícepodjednotkových RNA polymeráz, které jsou mimořádně konzervované mezi všemi buněčnými organismy. Tyto enzymy, spolu s RNA dependentními RNA polymerázami podílejícími se na umlčování genů, tvoří monofyletickou proteinovou rodinu, jejíž členové obsahují ve svém aktivním centru dva double-ψ β-barrel strukturní motivy. Do této rodiny patří také skupina převážně in silico predikovaných nekanonických DNA dependentních RNA polymeráz, které se od vícepodjednotkových RNA polymeráz odlišují redukovaným složením. Předpokládaná nekanonická RNA polymeráza, skládající se ze dvou podjednotek, je kódována také lineárními cytoplasmatickými plasmidy kvasinky Kluyveromyces lactis a velmi pravděpodobně přepisuje geny těchto plasmidů. Charakterizace unikátního transkripčního aparátu plasmidů Kluyveromyces lactis, s hlavním důrazem na nekanonickou RNA polymerázu, se stala cílem této práce. Bioinformatická analýza in silico byla použita k prověření důkazů vedoucích k předpokladu existence specifické RNA polymerázy. Následné genetické a biochemické metody byly použity pro: 1) produkci podjednotek předpokládané RNA polymerázy v několika expresních systémech; 2) testování interakce mezi některými komponentami...

Transcription is an essential step in the expression of genetic information. This process depends on protein complex of multisubunit RNA polymerases that are exceptionally conserved among all cellular organisms. These enzymes together with eukaryotic RNA-dependent RNA polymerases involved in gene silencing form a monophyletic protein family whose members contain two double-ψ β-barrel structural motifs in their active center. This family also includes a group of mainly in silico predicted non-canonical DNA-dependent RNA polymerases which differ from multisubunit RNA polymerases in reduced composition. Putative non-canonical RNA polymerase consisting of two subunits is also encoded by cytoplasmic linear plasmids of the yeast Kluyveromyces lactis and highly likely transcribes genes of these plasmids. Characterization of a unique transcription machinery of Kluyveromyces lactis plasmids with major emphasis on non-canonical RNA polymerase has become the aim of this work. Bioinformatic analysis in silico was used to examine the evidence leading to an assumption of existence of specific RNA polymerase. Subsequent genetic and biochemical methods were used for: 1) production of putative RNA polymerase subunits in several expression systems; 2) testing interaction between several components of transcription...