Design and construction of Src biosensor

Abstract

Kináza Src je známým protoonkogenem, který svou aktivitou zvyšuje buněčnou migraci a dělení buněk a je často nalézán v nádorových buňkách jako deregulovaný. Přesto není biologie kinázy Src úplně objasněna a je vyvíjeno velké úsilí na získání dalších informací o této kináze. V této diplomové práci je popsán návrh a příprava nového biosenzoru kinázy Src, který využívá geneticky kódované fluorofory odvozené od zeleného fluorescenčního protein a fyzikálního jevu nazývaného Försterův nebo fluorescenční rezonanční přenos energie (zkráceně FRET). Zmíněné fluorofory jsou zainkorporovány přímo do neporušené struktury kinázy Src takovým způsobem, aby nebyly narušeny vnitřní regulační mechanismy kinázy. Vytvořený biosensor reagoval na různé podněty, které rovněž aktivují Src divokého typu, nárůstem aktivující autofosforylace na tyrozínu 4161 a snížením FRET. Předběžné pokusy ukazují, že biosensor kinázy Src může být také použit pro sledování aktivace kinázy Src ve fixovaných buňkách.

Src kinase is a well-known proto-oncogene that contributes to cell migration and proliferation and is often found deregulated in tumors. Yet, biology of Src is not fully understood and great effort is made to find new tools for broadening knowledge about the kinase. In this thesis is described design and construction of a novel Src biosensor that exploits genetically encodable fluorophores derived from green fluorescent protein and Förster/fluorescence resonance energy transfer (FRET). The fluorophores are inserted directly into the structure of full-length c-Src in the way that should not impair the inner regulatory mechanisms of Src. The created biosensor proved to be sensitive to various stimuli, which also activate c-Src, by increase of activating autophosphorylation on Tyr4162 and decrease in FRET. Preliminary experiments indicate that the Src biosensor can be used to reflect Src activation in fixed cell as well.