Molekulární analýza rezistenčního genu vga(A)LC - identifikace klíčových aminokyselinových zbytků.

Abstract

Protein Vga(A) udílí stafylokokům rezistenci ke streptograminům A. Nedávno objevený protein Vga(A)LC se od proteinu Vga(A) liší jen 7 aminokyselinovými zbytky, nicméně tato diference je dostačující k posunu jeho substrátové specifity směrem k linkosamidům. Čtveřice těchto aminokyselin v centrální části proteinu (LGAG u Vga(A) a SVTS u Vga(A)LC) byla detekována jako rozhodující pro určení substrátové specifity. V rámci této diplomové práce bylo v genu vga(A)LC navrženo 5 variant bodových mutací za účelem zjištění podílu jednotlivých aminokyselin z výše zmíněné čtveřice na určení substrátové specifity proteinu. Mutace byly připraveny ve vektoru pGEM® -T a klonovány do kyvadlového vektoru pRB374. Připravené konstrukty byly elektroporací transformovány do citlivého kmene Staphylococcus aureus RN4220 a agarovou diluční metodou byly stanoveny hodnoty minimální inhibiční koncentrace (MIC) pro linkomycin, klindamycin a pristinamycin IIA. U jedné z mutací nebyla transformace úspěšná. Výsledky stanovení MIC pro čtyři zbylé mutace neumožňují jednoznačně stanovit podíl jednotlivých aminokyselin na určení substrátové specifity. Bylo zjištěno, že dvě aminokyseliny jsou důležité. Předpokládáme přípravu dalších mutací.

Protein Vga(A) gives staphylococci resistance to streptogramins A. The recently discovered protein Vga(A)LC differs from Vga(A) only by 7 amino acid residues, but this difference is sufficient for shift of its substrate specificity towards lincosamides. The group of four amino acids in the central part of protein (LGAG in Vga(A) and SVTS in Vga(A)LC) was detected to be crucial for the substrate specificity. In this diploma thesis 5 alternativesets of vga(A)LC gene point mutations were prepared in order to determine the impact of individual amino acids of the aforementioned group on the resistance phenotype. Mutations were prepared in vector pGEM® -T and cloned into shuttle vector pRB374. The prepared constructs were transformed by electroporation into the sensitive strain of Staphylococcus aureus RN4220 and values of minimum inhibitory concentration (MIC) were measured for lincomycin, clindamycin and pristinamycin IIA by the agar dilution method. The transformation was not successful in one of the mutations. Results of setting MIC for the remaining four mutations do not make it possible to specify uniquely the ratio of individual amino acids for determining substrate specificity. Two of the amino acids were found to be important. We anticipate preparation of more mutations.